PNAS: 癌癥外泌體hsa-miR-940通過靶向ARHGAP1和FAM134A促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的成骨表型

PNAS: 癌癥外泌體hsa-miR-940通過靶向ARHGAP1和FAM134A促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的成骨表型

癌的骨轉(zhuǎn)移性病變被歸類為成骨性或溶骨性病變。前列腺癌和乳腺癌患者通常分別表現(xiàn)出成骨型和溶骨型骨轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移灶中，腫瘤細(xì)胞與許多不同的細(xì)胞類型相互作用，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，導(dǎo)致成骨性或溶骨性表型。然而，負(fù)責(zé)骨重建的機(jī)制尚未完全闡明。近期美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊PNAS上發(fā)表了名為《Cancer-secreted hsa-miR-940 induces an osteoblastic phenotype in the bone metastatic microenvironment via targeting ARHGAP1 and FAM134A》（IF: 9.661）的文章，東京醫(yī)科和牙科大學(xué)（TMDU）的研究人員報(bào)告了一種miRNA分子，該分子可能在前列腺癌引起的骨重建中起關(guān)鍵作用。

在該項(xiàng)研究中，研究人員對(duì)多種人類癌細(xì)胞系分泌的外泌體miRNA進(jìn)行了全面的表達(dá)分析，并篩選出八種在成骨細(xì)胞表型誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞系分泌的外泌體中高表達(dá)的miRNA。其中，hsa-miR-940通過靶向結(jié)合ARHGAP1和FAM134A顯著促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。有趣的是，盡管MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞通常被稱為誘導(dǎo)溶骨性表型的癌細(xì)胞系，但是植入過表達(dá)miR-940的MDA-MB-231細(xì)胞同樣可以通過促進(jìn)宿主間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化，在由此產(chǎn)生的腫瘤中誘導(dǎo)廣泛的成骨細(xì)胞生成性病變。作者的研究結(jié)果表明骨轉(zhuǎn)移的表型可以在骨微環(huán)境中由癌細(xì)胞分泌的miRNA誘導(dǎo)。

技術(shù)路線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 鑒定由成骨細(xì)胞表型誘導(dǎo)癌細(xì)胞系顯著分泌的外泌體miRNA

Figure 1

圖1 A) C4-2B為誘導(dǎo)成骨性表型的癌細(xì)胞系，MDA-MB-231為誘導(dǎo)溶骨性表型的癌細(xì)胞系，在NOX / SCID（非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷）小鼠脛骨內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞后的X射線圖像和脛骨H&E染色。在溶骨性病變中觀察到幾個(gè)破骨細(xì)胞（箭頭）。

B) 前列腺癌細(xì)胞系分泌的外泌體miRNA芯片分析表明，與溶骨性表型誘導(dǎo)的癌細(xì)胞系分泌的外泌體相比，八種人的miRNA在成骨細(xì)胞表型誘導(dǎo)的癌細(xì)胞系分泌的外泌體中高度表達(dá)（使用來自非癌細(xì)胞的外泌體HEK293作為標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照，紅色表示較高的表達(dá)，而藍(lán)色表示相對(duì)于對(duì)照較低的表達(dá)）。

2. hsa-miR-940促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）的成骨分化

Figure 2

圖2 A) 構(gòu)建一種含有CD63（外泌體標(biāo)記物）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，與改良的黃色熒光蛋白（Venus）融合,然后用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染系統(tǒng)建立CD63-Venus穩(wěn)定表達(dá)癌癥細(xì)胞系（C4-2B-CD63-Venus）。通過超速離心從細(xì)胞上清液中分離Venus標(biāo)記的外泌體，并將其加入表達(dá)tdTomato的永生化hMSC中（左圖）；共聚焦顯微鏡圖像顯示Venus標(biāo)記的C4-2B外泌體摻入hMSC（中間圖）；qPCR分析顯示用C4-2B外泌體培養(yǎng)的hMSC中ALPL表達(dá)增強(qiáng)（右圖）。

B) 經(jīng)過14-d的骨化誘導(dǎo)后，hMSC堿性磷酸酶（ALP）分析表明，miR-940或miR-1260a過表達(dá)使ALP活性增加，明顯促進(jìn)了hMSCs的成骨分化。

C)在28-d誘導(dǎo)之后，對(duì)hMSC進(jìn)行von Kossa染色，發(fā)現(xiàn)miR-940過表達(dá)引起了廣泛的礦化結(jié)節(jié)（成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志）。

D) qPCR分析顯示7-d成骨誘導(dǎo)后，miR-940過表達(dá)的hMSC與空載體感染的hMSC相比BGLAP基因的mRNA表達(dá)沒有明顯差異，ALPL的mRNA表達(dá)增強(qiáng)。

3. ARHGAP1和FAM134A是hsa-miR-940促進(jìn)成骨分化的靶標(biāo)

Figure 3

圖3 A)用四個(gè)靶標(biāo)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)Target Scan，miRDB，miRanda和miRWalk進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測(cè)分析,19個(gè)在四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中重疊的候選基因鑒定為miR-940的靶標(biāo)。

B) 用各候選基因的siRNA轉(zhuǎn)染hMSC并在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)14天成骨誘導(dǎo)后，ARHGAP1和FAM134A的下調(diào)顯著增強(qiáng)hMSC的ALP活性。

C) 穩(wěn)定過表達(dá)ARHGAP1或FAM134A的hMSCs中ALP活性顯著降低。

D) E) hMSC中miR-940過表達(dá)降低了ARHGAP1和FAM134A蛋白水平以及它們的mRNA表達(dá)水平。

4. 癌癥分泌的hsa-miR-940通過外泌體轉(zhuǎn)移至間充質(zhì)干細(xì)胞并促進(jìn)成骨

Figure 4

圖4 A) 用慢病毒感染系統(tǒng)建立hsa-miR-940過表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞（上圖）；以空載體感染的MDA-MB-231細(xì)胞為對(duì)照，用pri-mir-940的基因組片段轉(zhuǎn)導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞，與對(duì)照細(xì)胞相比，過表達(dá)細(xì)胞顯示miR-940以及pri-mir-940的表達(dá)增強(qiáng)（左圖）；將來自過表達(dá)miR-940的MDA-MB-231細(xì)胞（Exo-miR-940）的外泌體或來自空載體感染細(xì)胞的外泌體（Exo-對(duì)照）加入到hMSC的培養(yǎng)基中，qPCR分析顯示摻入Exo-miR-940的hMSC比Exo對(duì)照組miR-940表達(dá)更強(qiáng)，而pri-mir-940的表達(dá)水平?jīng)]有改變（右圖）。

B) qPCR分析顯示在用Exo-miR-940培養(yǎng)的hMSC中ALPL的表達(dá)顯著上調(diào)。

C)蛋白質(zhì)印跡分析顯示ARHGAP1和FAM134A的蛋白質(zhì)水平在Exo-miR-940培養(yǎng)的hMSC中下調(diào)。

5. 癌癥分泌的hsa-miR-940在體內(nèi)的骨骼微環(huán)境中誘發(fā)成骨細(xì)胞損傷

Figure 5

圖5 A) 建立miR-940過表達(dá)的MDA-MB-231-CD63-Venus細(xì)胞，miR-940-H1和miR-940- H2表現(xiàn)出不同水平的miR-940過表達(dá)。

B) 將過表達(dá)miR-940的腫瘤細(xì)胞植入裸鼠的顱骨。

C) 過表達(dá)miR-940的MDA-MB-231細(xì)胞在內(nèi)部形成具有廣泛礦化組織的腫瘤。

D) H&E和von Kossa染色證實(shí)礦化組織由骨基質(zhì)組成，并被成骨細(xì)胞樣細(xì)胞或類骨質(zhì)包圍。

E) 用流式細(xì)胞術(shù)分離發(fā)育的腫瘤并分離GFP⁺ 宿主細(xì)胞，從分選的細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果顯示，在摻入癌細(xì)胞衍生的外泌體的GFP⁺ 宿主細(xì)胞中，miR-940靶基因ARHGAP1和FAM134A的蛋白質(zhì)水平被抑制。

F) 用三個(gè)樣品進(jìn)行qPCR分析，結(jié)果顯示其中兩個(gè)樣品與人非致瘤性前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1細(xì)胞）或骨組織相比具有更高的miR-940表達(dá)。

結(jié)論

前列腺癌分泌的hsa-miR-940在體外促進(jìn)了hMSCs的成骨分化，并在體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移性微環(huán)境中誘導(dǎo)了廣泛的成骨細(xì)胞損傷。該研究提供了癌癥分泌的miRNA誘導(dǎo)成骨細(xì)胞型骨轉(zhuǎn)移的證據(jù)，在骨骼微環(huán)境中作為向骨性因子。