m6A RNA甲基化測序
RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上,而N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發(fā)現(xiàn)microRNA,circRNA, lncRNA, rRNA, tRNA和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。 m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上,其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定。“編碼器(Writer)”即甲基轉(zhuǎn)移酶,目前已知這個復合物的成分有METTL3,METTL14, WTAP和KIAA1429;而ALKBH5和FTO作為去甲基酶(消碼器)可逆轉(zhuǎn)甲基化;m6A由m6A結(jié)合蛋白識別,目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白(讀碼器)有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白(包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3, YTHDC1和YTHDC2)和核不均一蛋白HNRNP家族(HNRNPA2B1和 HNRNPC)。在基因表達、蛋白翻譯和RNA剪切等正常生物過程中具有重要作用。近來有研究顯示m6A RNA甲基化在乳腺癌、惡性血液病、膠質(zhì)母細胞瘤、宮頸癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
圖 1 m6A修飾的酶系統(tǒng) 圖 2 m6A生物學功能
一、MeRIP-seq實驗流程
圖3 英拜 m6A RNA甲基化測序?qū)嶒灹鞒?
二、m6A甲基化測序分析內(nèi)容
u 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估及QC
u 測序序列與參考基因組比對
u RNA甲基化peak calling
u peak在基因組中的分布及注釋
u Peak在基因組中富集程度統(tǒng)計
u 差異RNA甲基化區(qū)域分析
u 差異RNA甲基化區(qū)域GO與KEGG富集分析
1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
DNA甲基化異常是膠質(zhì)瘤的表觀遺傳調(diào)控因子,但RNA甲基化在腫瘤包括惡性膠質(zhì)瘤(GBM)中的調(diào)控還尚未清楚。為研究m6A調(diào)節(jié)可能導致GBM患者臨床療效不佳,作者通過TCGA數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)ALKBH5在惡性膠質(zhì)瘤樣干細胞(GSCs)中高表達且與GBM 病人不良預后相關(guān),干擾ALKBH5 降低GSCs細胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖,進一步體內(nèi)驗證敲除ALKBH5可抑制腫瘤生長。
為研究ALKBH5的m6A作用機制,作者利用芯片和m6A-seq篩選到膠質(zhì)瘤增殖相關(guān)的FOXM1,最后通過qPCR、WB、免疫熒光、核質(zhì)分離WB/qPCR、RIP和MeRIP等實驗證明ALKBH5通過去甲基化調(diào)節(jié)FOXM1在GSCs中的表達。
為研究ALKBH5對FOXM1的作用是否受其他因子的調(diào)節(jié),作者研究了FOXM1的鄰近基因,發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXM1-AS與FOXM1序列互補,且共表達、共定位,進一步通過RIP, RNA pull down等實驗證明lncRNA FOXM1-AS促進ALKBH5 和FOXM1初級轉(zhuǎn)錄本的相互作用。最后通過細胞實驗進一步驗證ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下維持FOXM1的表達和細胞增殖,從而維持GSCs的干性。
A樣品要求:
樣品類型:細胞、新鮮組織或RNA樣品。
樣品量:細胞樣品請?zhí)峁┲辽?×107~108個細胞,組織樣品請?zhí)峁┲辽?g的組織塊,RNA樣品請?zhí)峁?00μg以上的總RNA。
樣品質(zhì)量:RNA無明顯降解,提取的總RNA OD260/280值在1.8~2.2之間,濃度 ≥ 500ng/μl,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥7。
樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊(切成~50mg的小塊)可用TRIZOL或RNA保護劑處理或液氮凍存后,-80℃保存。RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存。樣品保存期間避免反復凍融。
樣品運輸:樣品置于1.5 ml管中,封口膜封好,干冰運輸。