m6A RNA甲基化測序

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m6A RNA甲基化測序

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m6A RNA甲基化測序
     RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上,而N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發(fā)現(xiàn)microRNA,circRNA, lncRNA, rRNA, tRNA和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。 m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上,其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定。“編碼器(Writer)”即甲基轉(zhuǎn)移酶,目前已知這個復合物的成分有METTL3,METTL14, WTAP和KIAA1429;而ALKBH5和FTO作為去甲基酶(消碼器)可逆轉(zhuǎn)甲基化;m6A由m6A結(jié)合蛋白識別,目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白(讀碼器)有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白(包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3, YTHDC1和YTHDC2)和核不均一蛋白HNRNP家族(HNRNPA2B1和 HNRNPC)。在基因表達、蛋白翻譯和RNA剪切等正常生物過程中具有重要作用。近來有研究顯示m6A RNA甲基化在乳腺癌、惡性血液病、膠質(zhì)母細胞瘤、宮頸癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。


 
       圖 1 m6A修飾的酶系統(tǒng)               圖 2 m6A生物學功能


一、MeRIP-seq實驗流程

圖3 英拜 m6A RNA甲基化測序?qū)嶒灹鞒?

二、m6A甲基化測序分析內(nèi)容

u  測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估及QC

u  測序序列與參考基因組比對

u  RNA甲基化peak calling                  

u  peak在基因組中的分布及注釋

u  Peak在基因組中富集程度統(tǒng)計   

u  差異RNA甲基化區(qū)域分析

u  差異RNA甲基化區(qū)域GO與KEGG富集分析 



三、研究案例

1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
    DNA甲基化異常是膠質(zhì)瘤的表觀遺傳調(diào)控因子,但RNA甲基化在腫瘤包括惡性膠質(zhì)瘤(GBM)中的調(diào)控還尚未清楚。為研究m6A調(diào)節(jié)可能導致GBM患者臨床療效不佳,作者通過TCGA數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)ALKBH5在惡性膠質(zhì)瘤樣干細胞(GSCs)中高表達且與GBM 病人不良預后相關(guān),干擾ALKBH5  降低GSCs細胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖,進一步體內(nèi)驗證敲除ALKBH5可抑制腫瘤生長。
    為研究ALKBH5的m6A作用機制,作者利用芯片和m6A-seq篩選到膠質(zhì)瘤增殖相關(guān)的FOXM1,最后通過qPCR、WB、免疫熒光、核質(zhì)分離WB/qPCR、RIP和MeRIP等實驗證明ALKBH5通過去甲基化調(diào)節(jié)FOXM1在GSCs中的表達。
    為研究ALKBH5對FOXM1的作用是否受其他因子的調(diào)節(jié),作者研究了FOXM1的鄰近基因,發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXM1-AS與FOXM1序列互補,且共表達、共定位,進一步通過RIP, RNA pull down等實驗證明lncRNA FOXM1-AS促進ALKBH5 和FOXM1初級轉(zhuǎn)錄本的相互作用。最后通過細胞實驗進一步驗證ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下維持FOXM1的表達和細胞增殖,從而維持GSCs的干性。





圖4 ALKBH5敲除細胞中m6A修飾的特征和基因表達的變化
2、RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progressionthrough YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2. Hepatology,2017.(IF=13.2)

表觀遺傳改變極大地促進了人類癌癥的發(fā)生。傳統(tǒng)的表觀遺傳研究主要集中在DNA甲基化,組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)。最近,RNA各種可逆的化學修飾被認為是一種新的表觀遺傳調(diào)控方式。m6A是真核生物mRNA最常見的化學修飾,在調(diào)控mRNA穩(wěn)定性,剪切和翻譯方面具有重要的作用。
    作者使用轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了METTL3(甲基轉(zhuǎn)移酶3),一種主要的RNA N6-腺苷-甲基轉(zhuǎn)移酶,在人肝細胞癌(HCC)和多種實體腫瘤中顯著高表達。在臨床上,METTL3的過度表達與肝細胞癌患者不良預后有關(guān)。體外實驗證明敲除METTL3會顯著抑制HCC細胞增殖,遷移及克隆形成。體內(nèi)實驗證明敲除METTL3會明顯抑制HCC體內(nèi)成瘤和肺轉(zhuǎn)移。另外,使用CRISPR/dCas9-VP 64激活系統(tǒng),內(nèi)源性高表達METTL3會顯著促進HCC細胞在體外和體內(nèi)生長。通過轉(zhuǎn)錄組測序、m6A-Seq、MeRIP-PCR,作者確定了SOCS2(細胞因子信號2的抑制因子)作為METTL3介導的m6A修飾的下游靶基因。 敲除METTL3表達會消除SOCS2 mRNA m6A修飾并增強SOCS2 mRNA表達。m6A介導的SOCS2 mRNA降解是依賴于m6A“讀取器”蛋白YTHDF2。總之,METTL3在HCC大部分高表達中,并通過m6A-YTHDF2依賴機制抑制SOCS2表達從而促進HCC進展。因此,作者發(fā)現(xiàn)了在肝腫瘤發(fā)生過程中表觀遺傳改變的一種新機制。


圖5 RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶METLLT3在肝癌組織中高表達
(轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果及TCGA數(shù)據(jù)庫分析)

3、N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One 2015,
     在許多不同種類的RNA中,都已觀察到N6 -腺苷(m6A)的甲基化,但其在microRNAs中還沒有被研究。研究者在FTO1C1, FTO2D4 和 FTO3C3細胞系中,通過敲除m6A甲基轉(zhuǎn)移酶FTO篩選到表達差異的microRNA,說明miRNA受m6A甲基化的調(diào)控。進一步通過MeRIP-Seq發(fā)現(xiàn)相當一部分的microRNA具有m6A修飾。通過motif分析,他們發(fā)現(xiàn)了區(qū)分甲基化和非甲基化microRNA的一致序列。該文章所述的表觀遺傳修飾在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的復雜性上增加了一個新的層次。


圖7 FTO敲除對甲基化的miRNAs的穩(wěn)定狀態(tài)的影響。


四、送樣要求

A樣品要求:

  1. 樣品類型:細胞、新鮮組織或RNA樣品。

  2. 樣品量:細胞樣品請?zhí)峁┲辽?×107~108個細胞,組織樣品請?zhí)峁┲辽?g的組織塊,RNA樣品請?zhí)峁?00μg以上的總RNA。

  3. 樣品質(zhì)量:RNA無明顯降解,提取的總RNA OD260/280值在1.8~2.2之間,濃度 ≥ 500ng/μl,28S:18S ≥ 1.5,RIN ≥7。

  4. 樣品保存:細胞樣品或新鮮組織塊(切成~50mg的小塊)可用TRIZOL或RNA保護劑處理或液氮凍存后,-80℃保存。RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中,-80℃保存。樣品保存期間避免反復凍融。

  5. 樣品運輸:樣品置于1.5 ml管中,封口膜封好,干冰運輸。



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