與人類線粒體疾病相關(guān)的CO2敏感的tRNA修飾

由Tsutomu Suzuki帶領(lǐng)的日本團隊于2018年5月在Nature Communicatio n雜志（IF=12.35）發(fā)的一篇文章：一般認(rèn)為，tRNAs修飾是穩(wěn)定和靜態(tài)的，并且他們的修飾頻率幾乎不被調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在5個物種的線粒體tRNAs中，N6 –蘇氨酸氨基甲酰腺苷酸（t6A）主要發(fā)生在線粒體的第37號位置。這篇文章中發(fā)現(xiàn)：YRDC和OSGEPL1是形成t6A37不可或缺的組分，這主要是通過L-蘇氨酸、ATP和CO2/碳酸氫鹽作為底物來實現(xiàn)的。同時，在OSGEPL1基因敲除細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了呼吸系統(tǒng)缺陷，并且OSGEPL1基因敲除后能夠阻礙線粒體翻譯。在從MERRF樣病人細(xì)胞中分離出突變的mt-tRNAs中發(fā)現(xiàn)t6A37低表達，這就說明缺乏t6A37會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。t6A37的動力學(xué)表明CO2/碳酸氫鹽的Km值非常高（31mM），這就是說明CO2/碳酸氫鹽是t6A37形成的限速因子。與此一致的是還發(fā)現(xiàn)用沒有加入碳酸氫鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人細(xì)胞中分離的mt-tRNAs中的t6A37也是低表達。這些發(fā)現(xiàn)說明t6A37是由傳感細(xì)胞內(nèi)CO2/碳酸氫鹽的濃度調(diào)節(jié)的。

技術(shù)路線:

結(jié)果:

圖1. 人mt-RNAs的t6A。a. tRNAs的化學(xué)結(jié)構(gòu)。橢圓虛線代表CO2/碳酸氫鹽，方形虛線代表L-絲氨酸。b. 5個帶有t6A37的人mt-tRNAs的二級結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄后修飾位點。

1.  YRDC參與線粒體t6A37的形成。

圖2. a. Hela細(xì)胞中進行YRDC亞細(xì)胞定位，F(xiàn)LAG抗體進行免疫熒光染色。細(xì)胞核和染色質(zhì)分別用DAPI（藍(lán)色）和Mito Tracker（紅色）。注：S17F、A15F/S17F （YRDC進行MTS區(qū)突變）。 b. WB方法在線粒體中，對YRDC進行定位。注：a.a. Δ2–15（YRDC進行N-末端突變）和A15F/S17F （YRDC進行MTS區(qū)突變）， CO1（線粒體的marker）、GAPDH（細(xì)胞質(zhì)的marker）。c. 確定YRDC在MTS上的切割位點。上：預(yù)測的MTS（藍(lán)色）和大腸桿菌相同的保守區(qū)域（綠色）代表YRDC。白色和黑色箭頭所指位置分別是Hela細(xì)胞中長和短YRDC亞型的多切割位點。中和下：CID光譜代表在52位點上短亞型切割位點的N-末端胰蛋白酶肽序列。CID的前體是m/z565.28。d.利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除YRDC基因。人YRDC基因和CRISPR-Cas9系統(tǒng)的插入位點（陰影部分代表編碼區(qū)，打開的盒子部分代表外顯子的非轉(zhuǎn)錄區(qū)域，線代表內(nèi)含子，插入在WT YRDC的1號外顯子）。劃線部分是sgRNA的靶點序列。并產(chǎn)生了MTS突變的細(xì)胞系（FS#1）的序列，插入的C用紅色表示。ef. 離子色譜圖（XICs）分析通過從WT、FS#1細(xì)胞系分離的mt-tRNAIle和ct-tRNAIle中A37（top）和t6A37（bottom）的表達情況。

2. OSGEPL1參與線粒體t6A37的形成。

圖3. OSGEPL1參與線粒體t6A37的形成。a. Hela細(xì)胞中進行OSGEPL1亞細(xì)胞定位，F(xiàn)LAG抗體進行免疫熒光染色。細(xì)胞核和染色質(zhì)分別用DAPI（藍(lán)色）和Mito Tracker（紅色）。注：Δ2–33 （OSGEPL1進行MTS突變）。c. 確定OSGEPL1在MTS上的切割位點。CID光譜代表OSGEPL1從35位開始的N-末端多肽的序列。CID的前體是m/z685.38。c. 利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除OSGEPL1基因。人OSGEPL1基因和CRISPR-Cas9系統(tǒng)的插入位點（陰影部分代表編碼區(qū)，打開的盒子部分代表外顯子的非轉(zhuǎn)錄區(qū)域，線代表內(nèi)含子，插入在WT OSGEPL1的3號外顯子）。劃線部分是sgRNA的靶點序列。并產(chǎn)生了MTS突變的細(xì)胞系（KO#1和KO#2）的序列，插入的A用紅色表示，刪除序列用虛線代表。d. WB檢測OSGEPL1的敲除情況。ATP5A（線粒體marker作為control）。ef. 離子色譜圖（XICs）分析通過從WT、KO#1、加入OSGEPL1的KO#1和加入突變OSGEPL1的 KO#1細(xì)胞系分離的mt-tRNAIle和ct-tRNAIle中A37（top）和t6A37（bottom）的表達情況。

3. OSGEPL1缺失導(dǎo)致線粒體功能紊亂。

圖4. a. WT, OSGEPL1 KO#1和OSGEPL1 KO#2細(xì)胞的生長曲線圖，左：培養(yǎng)基加入葡萄糖作為基礎(chǔ)C源，右：培養(yǎng)基中加入半乳糖培養(yǎng)作為基礎(chǔ)C源。b. 癢耗率（COR）的測定。c. ATP穩(wěn)態(tài)水平的檢測。d. 呼吸鏈復(fù)合物I、II、III和IV（CI-IV）的檢測。e. ND2和ND5（CI的亞單位）核NDUFB8（核編碼CI亞單位）的穩(wěn)態(tài)水平。f. 脈沖標(biāo)記檢測線粒體的翻譯活性。g. 通過northern blot 檢測mt-tRNAsLys中氨酰化水平。

4. 線粒體mt-tRNA的體外重組的鑒定和突變后導(dǎo)致線粒體疾病。

圖5. a. mt-tRNAsThr中轉(zhuǎn)錄本t6A37體外形成（Thr (95%)）（其他mt-tRNAs在補充材料中：Asn (98%)、Lys (95%)、Ile (67%)、Ser(AGY) (34%)）。b. 左：mt-tRNAsIle中轉(zhuǎn)錄本t6A37的形成（Ile (67%)）；右：來自O(shè)SGEPL1-KO的t6A37修飾后。c. Thr, Lys和Asn各位點突變后對mt-tRNAs中t6A37形成的影響。d.mt-tRNAIle致病突變位點G8（G4296A）突變對線粒體t6A37形成的影響。e. 病人細(xì)胞中分離出的mt-tRNAThr 進行A15923突變后對線粒體t6A37形成情況。

5. 線粒體t6A37對體內(nèi)的CO2比較敏感。

圖6. 線粒體t6A37的形成對細(xì)胞內(nèi)碳酸氫鹽濃度很敏感。a. mt-tRNAThr  中t 6A37形成的動力學(xué)檢測。b. 在非碳酸氫鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中t6A37發(fā)生修飾的水平。

結(jié)論：

圖7. 在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中t6A37的形成和碳酸氫鹽的新陳代謝。線粒體中TCA循環(huán)產(chǎn)生的CO2通過碳酸酐酶5（CA5）形成碳酸氫鹽 。此外，線粒體CO2通過碳酸酐酶2（CA2）轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)和水里。在低氧條件下, 碳酸酐酶9（CA9）通過HIF-1途徑在細(xì)胞表面過度表達。CA9產(chǎn)生大量的細(xì)胞外碳酸氫鹽。然后，細(xì)胞吸收細(xì)胞外碳酸氫鹽，進一步中和乳酸鹽并防止酸化，細(xì)胞質(zhì)中的YRDC復(fù)合物和線粒體中的OSGEPL1復(fù)合物調(diào)節(jié)tRNA中t6A37的形成。在沒有碳酸氫鹽培養(yǎng)的條件下，兩個tRNAs中的t6A37處于低修飾水平，跟低氧實體瘤一樣，表明通過傳感細(xì)胞內(nèi)碳酸氫鹽的轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)。

參考文獻：Huan Lin , Kenjyo Miyauchi, Tai Harada, Ryo Okita, Eri Takeshita, Hirofumi Komaki2, Kaoru Fujioka, Hideki Yagasaki, Yu-ichi Goto, Kaori Yanaka, Shinichi Nakagawa, Yuriko Sakaguchi1& Tsutomu Suzuki. CO2-sensitive tRNA modification associated with human mitochondrial disease. Nature communications. (2018) 9:1875.