Drosophila tsRNAs preferentially suppress general　translation machinery via antisense pairing and　participate in cellular starvation response

轉(zhuǎn)運(yùn)RNA衍生的小RNA（tsRNA）是一類新興的小RNA，但它們的調(diào)節(jié)作用尚未得到很好的理解。近日，北京生命科學(xué)中心陸劍研究組在Nucleic Acids Research（IF=11.561）研究發(fā)表了tsRNA介導(dǎo)的果蠅調(diào)節(jié)的分子機(jī)制和后果。通過分析495個(gè)公共小RNA文庫，他們證明了這些RNA在果蠅中是保守的，普遍存在的。通過對(duì)單鏈tsRNA模擬和模擬轉(zhuǎn)染的S2細(xì)胞進(jìn)行mRNA測序和核糖體分析，他們發(fā)現(xiàn)tsRNA通過保守的互補(bǔ)序列匹配識(shí)別靶mRNA，并通過翻譯抑制抑制靶基因。目標(biāo)預(yù)測表明tsRNA優(yōu)先抑制一般翻譯機(jī)制的關(guān)鍵組分的翻譯，這解釋了tsRNA如何抑制全球mRNA翻譯。血清饑餓實(shí)驗(yàn)證實(shí)tsRNA通過優(yōu)先靶向核糖體蛋白和翻譯起始或延伸參與細(xì)胞饑餓反應(yīng)。在正常和饑餓條件下敲除S2細(xì)胞中的AGO2揭示了tsRNA介導(dǎo)的調(diào)節(jié)對(duì)AGO2的依賴性。他們還通過熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證了代表性tsRNA對(duì)細(xì)胞全局翻譯和特定靶標(biāo)的抑制作用。他們的研究表明，tsRNA介導(dǎo)的調(diào)節(jié)可能對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)中的能量穩(wěn)態(tài)和代謝適應(yīng)至關(guān)重要。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1.果蠅中，tsRNA對(duì)果蠅的小RNA表達(dá)譜有顯著貢獻(xiàn)。

 圖1 tsRNA在果蠅中是保守的，豐富的和普遍的

(A)tsRNA reads和miRNA reads在個(gè)體不同的發(fā)育組織中的比率。字母代表每個(gè)部位（胚胎、幼蟲、蛹、頭、體、睪丸和卵巢）的首字母縮寫。還顯示了tsRNA reads與所有基因組圖譜reads的平均比率，不包括rRNA，snRNA和snoRNA（紅線）。(B)單個(gè)20-22nt tsRNA種類（N = 1725，RPM> 1）的標(biāo)準(zhǔn)化豐度在D. melanogaster（x軸）和果蠅（y軸）中共享，以百萬分之一（RPM）測量。(C)在不同發(fā)育類別的小RNA文庫中，總tsRNA（20-29nt）中的短tsRNA（20-23nt）的百分比。字母定義與Ａ相同。(D)tsRNA長度在AGO1、AGO2、AGO3、AUB和PIWI-IP文庫中的分布。（E）每個(gè)文庫中成熟tRNA上每個(gè)核苷酸位置的tsRNA的相對(duì)覆蓋率（N = 495）。

2.果蠅tsRNAs可能抑制全局mRNA的翻譯，并且通過保守的反義匹配調(diào)節(jié)靶基因的翻譯。

 
圖2將tsRNA模擬物轉(zhuǎn)染到S2細(xì)胞中抑制全局翻譯活性

(A)在成熟tRNA中三種tsRNAs tsRNA AspGUC（T3），tsRNA GluCUC（T6）和tsRNA LysUUU（T10）的結(jié)構(gòu)的示意圖。 tsRNA為紅色，反密碼子為藍(lán)色。(B)使用來自沒有任何RNA序列（模擬，黑色）轉(zhuǎn)染的S2細(xì)胞的10 45％蔗糖梯度分離的RNA的吸光度曲線（在UV波長254nm處），具有陰性對(duì)照小RNA（ss-NC，橙色）， tsRNA T3（紅色），T6（綠色）或T10（藍(lán)色）。(C)多核糖體分區(qū)（P）內(nèi)的聚集強(qiáng)度與單體分區(qū)（M）的比率通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)的中值歸一化。 星號(hào)表示轉(zhuǎn)染和模擬之間顯著不同的P / M比率。(D)Ribo-seq reads的散點(diǎn)圖對(duì)T3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中各個(gè)基因的mRNA-seq reads計(jì)數(shù)。 藍(lán)色圓圈代表具有> 50個(gè)mRNA-seq讀數(shù)和> 50個(gè)Ribo-seq讀數(shù)的基因。

3.果蠅tsRNAs通過保守的反義匹配調(diào)節(jié)靶基因的翻譯。

 
圖3 tsRNA通過反義配對(duì)抑制靶mRNA的翻譯

(A)所有基因的翻譯效率（TE）變化的累積分布。 x軸是用tsRNA模擬物轉(zhuǎn)染的S2細(xì)胞中的log 2（FC TE）（從左到右的T3，T6，T10）與用ss-NC轉(zhuǎn)染相比。具有7-mer位點(diǎn)的基因在果蠅（Drosophila melanogaster）和果蠅（Drosophila virilis）之間保守，與tsRNA的任何部分配對(duì)的反義基因被定義為tsRNA靶基因。紅色，綠色，藍(lán)色，灰色分別表示具有一個(gè)，兩個(gè)，兩個(gè)，０個(gè)以上保守的tsRNA靶位點(diǎn)的基因。每個(gè)類別中的基因數(shù)量用括號(hào)表示。星號(hào)表示與ss-NC對(duì)照組相比TE FC的顯著差異。(B)tsRNA的抑制效率與mRNA轉(zhuǎn)錄物中tsRNA靶位點(diǎn)的位置無關(guān)“No sites”：沒有保守的tsRNA靶位點(diǎn)的mRNA;其他依次表示有在該區(qū)域有保守的位點(diǎn)。每個(gè)類別中的基因數(shù)量在括號(hào)中給出。(C)顯示tsRNA反義配對(duì)與mRNA的不同位置中的進(jìn)化上保守的7聚體靶位點(diǎn)（紅色）的方案。

4.AGO2結(jié)合的tsRNA優(yōu)先抑制一般翻譯機(jī)制的組分。

 
圖4 tsRNA以AGO2依賴性方式介導(dǎo)翻譯抑制

(A)對(duì)AGO2結(jié)合的tsRNA的前600個(gè)靶基因的GO分析。與翻譯相關(guān)用紅色表示。(B)AGO2結(jié)合的tsRNA對(duì)RpS9 mRNA的靶位點(diǎn)密度。 y軸是每個(gè)靶位點(diǎn)的-log 2（AGO2結(jié)合的tsRNA的reads）。(C)在正常條件下培養(yǎng)的AGO2敲低與ds-NC轉(zhuǎn)染的S2細(xì)胞中的TE的log 2（FC）。(D)在敲除AGO2后，mRNA中的tsRNA靶位點(diǎn)的密度（x軸）與翻譯去抑制（y軸）的程度正相關(guān)。 在該分析中使用AGO2結(jié)合的tsRNA的前351個(gè)靶標(biāo)。 RP / IEF以紅色顯示（N = 48）。

5.tsRNA參與細(xì)胞饑餓反應(yīng)。

 
圖5 tsRNA參與果蠅細(xì)胞饑餓反應(yīng)

(A)血清饑餓反應(yīng)中每種tRNA類型５’，中間，３’ tsRNA豐度。(B)來自５’，中間，３’　tsRNA中tsRNA豐度的變化是不同。 血清饑餓下的上調(diào)顯示為藍(lán)色，血清饑餓下的下調(diào)顯示為紅色。 y軸是三種類型的tsRNA中上調(diào)/下調(diào)的tsRNA的百分比。(C)正常和饑餓的S2細(xì)胞中tsRNA的豐度（RPM）。 不受AGO1和AGO2結(jié)合的tsRNA為灰色，僅由AGO2結(jié)合的tsRNA為紅色，僅由AGO1結(jié)合的tsRNA為黑色，由AGO1和AGO2結(jié)合的tsRNA為橙色。(D)在S2細(xì)胞的四種不同條件下對(duì)AGO2進(jìn)行Western印跡。 S2細(xì)胞的四種條件：在正常條件下培養(yǎng)，血清饑餓，血清饑餓下AGO2敲低，和AGO2敲低。

6.tsRNA和miRNA介導(dǎo)的調(diào)節(jié)在很大程度上是獨(dú)立的。

 
圖6 tsRNA抑制細(xì)胞饑餓反應(yīng)中靶基因的翻譯

(A)通過上調(diào)的AGO2結(jié)合表現(xiàn)出更高的靶位點(diǎn)的mRNA（UpSitesscore，x-軸）和經(jīng)過基因翻譯的表達(dá)（y軸）相關(guān)性。顯示了Spearman的相關(guān)性和P值。(B)由上調(diào)的AGO2結(jié)合的tsRNA靶向的基因（UpSites得分> 3 / kb，N = 408）在饑餓的S2細(xì)胞中降低了TE。(C)FC TE（log 2 scaled，y軸　血清饑餓下的５’TOP基因）和UpSites得分（x軸）之間的顯著負(fù)相關(guān)（N = 115）。(D)在正常（左）和正常（左）和下饑餓的S2細(xì)胞（UpSites> 3和５’TOP基因未包括，N = 376）中上調(diào)的tsRNA的最高得分靶基因的TEs（y軸）的變化。

7.得到一個(gè)tsRNAs如何抑制特異性靶標(biāo)和全局mrna翻譯的模型。

 
圖7 tsRNA如何抑制特定靶標(biāo)和全局mRNA翻譯的模型

(A)本研究中S2細(xì)胞砂測序工作流程的實(shí)驗(yàn)處理概述。（B）tsRNA通過反義配對(duì)優(yōu)先靶向RP和IEF以調(diào)節(jié)全局翻譯活性。(1)AGO2結(jié)合從tRNA切割的tsRNA，并且那些tsRNA特異性結(jié)合具有部分互補(bǔ)性的mRNA并抑制它們的翻譯。(2)在饑餓的情況下，翻譯抑制也受mTOR途徑調(diào)節(jié)5’ TOP基因和一些tsRNA靶標(biāo)與5’ TOP基因（綠色）。(3)一些RP和IEF的翻譯被tsRNA壓制，這反過來抑制了全球翻譯活動(dòng)。

 
圖8 使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證tsRNA對(duì)全局翻譯活性和特定靶位點(diǎn)的抑制作用

(A)將tsRNA模擬物和psiCHECK-2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到S2細(xì)胞中降低了螢火蟲熒光素酶的活性。顏色鍵顯示tsRNA模擬物的不同最終濃度。(B)較高濃度的tsRNA混合物在psiCHECK-2質(zhì)粒上引起較低的螢火蟲（紅色）和海腎（藍(lán)色）熒光素酶活性。 *** P <0.001（每次測定進(jìn)行三次重復(fù)）。(C)tsRNA T16與RpL8和PpL27 mRNA中預(yù)測的靶向位點(diǎn)之間的堿基配對(duì)。靶位點(diǎn)兩側(cè)的側(cè)翼5bp（以青色突出顯示）包括在合成的靶向位點(diǎn)中。（D和E）用T16共轉(zhuǎn)染的S2細(xì)胞和含有靶位點(diǎn)的psiCHECK-2質(zhì)粒（RpL8，D; RpL27，E）的相對(duì)熒光素酶活性顯著低于用ss-NC和相同質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的那些質(zhì)粒。