Drosophila tsRNAs preferentially suppress general　translation machinery via antisense pairing and　participate in cellular starvation response

轉運RNA衍生的小RNA（tsRNA）是一類新興的小RNA，但它們的調節(jié)作用尚未得到很好的理解。近日，北京生命科學中心陸劍研究組在Nucleic Acids Research（IF=11.561）研究發(fā)表了tsRNA介導的果蠅調節(jié)的分子機制和后果。通過分析495個公共小RNA文庫，他們證明了這些RNA在果蠅中是保守的，普遍存在的。通過對單鏈tsRNA模擬和模擬轉染的S2細胞進行mRNA測序和核糖體分析，他們發(fā)現(xiàn)tsRNA通過保守的互補序列匹配識別靶mRNA，并通過翻譯抑制抑制靶基因。目標預測表明tsRNA優(yōu)先抑制一般翻譯機制的關鍵組分的翻譯，這解釋了tsRNA如何抑制全球mRNA翻譯。血清饑餓實驗證實tsRNA通過優(yōu)先靶向核糖體蛋白和翻譯起始或延伸參與細胞饑餓反應。在正常和饑餓條件下敲除S2細胞中的AGO2揭示了tsRNA介導的調節(jié)對AGO2的依賴性。他們還通過熒光素酶報告基因檢測驗證了代表性tsRNA對細胞全局翻譯和特定靶標的抑制作用。他們的研究表明，tsRNA介導的調節(jié)可能對細胞系統(tǒng)中的能量穩(wěn)態(tài)和代謝適應至關重要。

技術路線

主要結果

1.果蠅中，tsRNA對果蠅的小RNA表達譜有顯著貢獻。

 圖1 tsRNA在果蠅中是保守的，豐富的和普遍的

(A)tsRNA reads和miRNA reads在個體不同的發(fā)育組織中的比率。字母代表每個部位（胚胎、幼蟲、蛹、頭、體、睪丸和卵巢）的首字母縮寫。還顯示了tsRNA reads與所有基因組圖譜reads的平均比率，不包括rRNA，snRNA和snoRNA（紅線）。(B)單個20-22nt tsRNA種類（N = 1725，RPM> 1）的標準化豐度在D. melanogaster（x軸）和果蠅（y軸）中共享，以百萬分之一（RPM）測量。(C)在不同發(fā)育類別的小RNA文庫中，總tsRNA（20-29nt）中的短tsRNA（20-23nt）的百分比。字母定義與Ａ相同。(D)tsRNA長度在AGO1、AGO2、AGO3、AUB和PIWI-IP文庫中的分布。（E）每個文庫中成熟tRNA上每個核苷酸位置的tsRNA的相對覆蓋率（N = 495）。

2.果蠅tsRNAs可能抑制全局mRNA的翻譯，并且通過保守的反義匹配調節(jié)靶基因的翻譯。

 
圖2將tsRNA模擬物轉染到S2細胞中抑制全局翻譯活性

(A)在成熟tRNA中三種tsRNAs tsRNA AspGUC（T3），tsRNA GluCUC（T6）和tsRNA LysUUU（T10）的結構的示意圖。 tsRNA為紅色，反密碼子為藍色。(B)使用來自沒有任何RNA序列（模擬，黑色）轉染的S2細胞的10 45％蔗糖梯度分離的RNA的吸光度曲線（在UV波長254nm處），具有陰性對照小RNA（ss-NC，橙色）， tsRNA T3（紅色），T6（綠色）或T10（藍色）。(C)多核糖體分區(qū)（P）內的聚集強度與單體分區(qū)（M）的比率通過對照實驗的中值歸一化。 星號表示轉染和模擬之間顯著不同的P / M比率。(D)Ribo-seq reads的散點圖對T3轉染實驗中各個基因的mRNA-seq reads計數(shù)。 藍色圓圈代表具有> 50個mRNA-seq讀數(shù)和> 50個Ribo-seq讀數(shù)的基因。

3.果蠅tsRNAs通過保守的反義匹配調節(jié)靶基因的翻譯。

 
圖3 tsRNA通過反義配對抑制靶mRNA的翻譯

(A)所有基因的翻譯效率（TE）變化的累積分布。 x軸是用tsRNA模擬物轉染的S2細胞中的log 2（FC TE）（從左到右的T3，T6，T10）與用ss-NC轉染相比。具有7-mer位點的基因在果蠅（Drosophila melanogaster）和果蠅（Drosophila virilis）之間保守，與tsRNA的任何部分配對的反義基因被定義為tsRNA靶基因。紅色，綠色，藍色，灰色分別表示具有一個，兩個，兩個，０個以上保守的tsRNA靶位點的基因。每個類別中的基因數(shù)量用括號表示。星號表示與ss-NC對照組相比TE FC的顯著差異。(B)tsRNA的抑制效率與mRNA轉錄物中tsRNA靶位點的位置無關“No sites”：沒有保守的tsRNA靶位點的mRNA;其他依次表示有在該區(qū)域有保守的位點。每個類別中的基因數(shù)量在括號中給出。(C)顯示tsRNA反義配對與mRNA的不同位置中的進化上保守的7聚體靶位點（紅色）的方案。

4.AGO2結合的tsRNA優(yōu)先抑制一般翻譯機制的組分。

 
圖4 tsRNA以AGO2依賴性方式介導翻譯抑制

(A)對AGO2結合的tsRNA的前600個靶基因的GO分析。與翻譯相關用紅色表示。(B)AGO2結合的tsRNA對RpS9 mRNA的靶位點密度。 y軸是每個靶位點的-log 2（AGO2結合的tsRNA的reads）。(C)在正常條件下培養(yǎng)的AGO2敲低與ds-NC轉染的S2細胞中的TE的log 2（FC）。(D)在敲除AGO2后，mRNA中的tsRNA靶位點的密度（x軸）與翻譯去抑制（y軸）的程度正相關。 在該分析中使用AGO2結合的tsRNA的前351個靶標。 RP / IEF以紅色顯示（N = 48）。

5.tsRNA參與細胞饑餓反應。

 
圖5 tsRNA參與果蠅細胞饑餓反應

(A)血清饑餓反應中每種tRNA類型５’，中間，３’ tsRNA豐度。(B)來自５’，中間，３’　tsRNA中tsRNA豐度的變化是不同。 血清饑餓下的上調顯示為藍色，血清饑餓下的下調顯示為紅色。 y軸是三種類型的tsRNA中上調/下調的tsRNA的百分比。(C)正常和饑餓的S2細胞中tsRNA的豐度（RPM）。 不受AGO1和AGO2結合的tsRNA為灰色，僅由AGO2結合的tsRNA為紅色，僅由AGO1結合的tsRNA為黑色，由AGO1和AGO2結合的tsRNA為橙色。(D)在S2細胞的四種不同條件下對AGO2進行Western印跡。 S2細胞的四種條件：在正常條件下培養(yǎng)，血清饑餓，血清饑餓下AGO2敲低，和AGO2敲低。

6.tsRNA和miRNA介導的調節(jié)在很大程度上是獨立的。

 
圖6 tsRNA抑制細胞饑餓反應中靶基因的翻譯

(A)通過上調的AGO2結合表現(xiàn)出更高的靶位點的mRNA（UpSitesscore，x-軸）和經(jīng)過基因翻譯的表達（y軸）相關性。顯示了Spearman的相關性和P值。(B)由上調的AGO2結合的tsRNA靶向的基因（UpSites得分> 3 / kb，N = 408）在饑餓的S2細胞中降低了TE。(C)FC TE（log 2 scaled，y軸　血清饑餓下的５’TOP基因）和UpSites得分（x軸）之間的顯著負相關（N = 115）。(D)在正常（左）和正常（左）和下饑餓的S2細胞（UpSites> 3和５’TOP基因未包括，N = 376）中上調的tsRNA的最高得分靶基因的TEs（y軸）的變化。

7.得到一個tsRNAs如何抑制特異性靶標和全局mrna翻譯的模型。

 
圖7 tsRNA如何抑制特定靶標和全局mRNA翻譯的模型

(A)本研究中S2細胞砂測序工作流程的實驗處理概述。（B）tsRNA通過反義配對優(yōu)先靶向RP和IEF以調節(jié)全局翻譯活性。(1)AGO2結合從tRNA切割的tsRNA，并且那些tsRNA特異性結合具有部分互補性的mRNA并抑制它們的翻譯。(2)在饑餓的情況下，翻譯抑制也受mTOR途徑調節(jié)5’ TOP基因和一些tsRNA靶標與5’ TOP基因（綠色）。(3)一些RP和IEF的翻譯被tsRNA壓制，這反過來抑制了全球翻譯活動。

 
圖8 使用雙熒光素酶報告基因檢測驗證tsRNA對全局翻譯活性和特定靶位點的抑制作用

(A)將tsRNA模擬物和psiCHECK-2質粒共轉染到S2細胞中降低了螢火蟲熒光素酶的活性。顏色鍵顯示tsRNA模擬物的不同最終濃度。(B)較高濃度的tsRNA混合物在psiCHECK-2質粒上引起較低的螢火蟲（紅色）和海腎（藍色）熒光素酶活性。 *** P <0.001（每次測定進行三次重復）。(C)tsRNA T16與RpL8和PpL27 mRNA中預測的靶向位點之間的堿基配對。靶位點兩側的側翼5bp（以青色突出顯示）包括在合成的靶向位點中。（D和E）用T16共轉染的S2細胞和含有靶位點的psiCHECK-2質粒（RpL8，D; RpL27，E）的相對熒光素酶活性顯著低于用ss-NC和相同質粒共轉染的那些質粒。