基于生殖系拷貝數(shù)變異(CNV)的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）幫你找到癌癥相關(guān)snoRNA!

近年來，非編碼RNA的研究從miRNA到lncRN到circRNA，而核仁小分子RNA(snoRNA)的研究起源較早，功能單一，之后的很長一段時間，snoRNA的研究陷入低潮。核仁小分子RNA(snoRNA)是一類廣泛存在于真核生物細(xì)胞核仁的小分子非編碼RNA，長度0-300nt, 具有保守的結(jié)構(gòu)元件，并按它們的結(jié)構(gòu)分為三大類：box C/D snoRNA、 box H/ACA snoRNA 和 MRP RNA。其中box C/D 和 box H/ACA主要通過堿基配對的方式分別指導(dǎo)著核糖體RNA的二氧甲基化和假尿嘧啶化修飾。此外，也有研究報道snoRNA參與snRNA、tRNA和mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾。近幾年，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的數(shù)據(jù)表明snoRNA在腫瘤中被異常調(diào)控，并發(fā)揮著功能。2018年8月，北京蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國放射醫(yī)學(xué)研究所周鋼橋課題組在Gastroenterology （IF=20.773）發(fā)表了名為“Germline Duplication of SNORA18L5  Increases Risk for HBV-related Hepatocellular Carcinoma by Altering Localization of Ribosomal Proteins and Decreasing Levels of p53” ,該研究是基于生殖系拷貝數(shù)變異(CNV)的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），通過對比1583例乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝癌患者與1540例乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的非肝癌患者，發(fā)現(xiàn)了一個低頻重復(fù)染色體15q13.3與乙型肝炎病毒相關(guān)的肝癌患病風(fēng)險密切相關(guān)（P=3.17 × 10–8;odds ratio, 12.02)。15q13.3的拷貝數(shù)與SNORA18L5在肝組織中的表達(dá)相關(guān)。過表達(dá)SNORA18L5的增加了小鼠肝癌細(xì)胞的增殖和移植瘤的生長;干擾SNORA18L5降低了肝癌的增殖和腫瘤的生長。SNORA18L5在HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中的過表達(dá)可抑制p53依賴性細(xì)胞周期阻滯和凋亡。SNORA18L5的過表達(dá)導(dǎo)致核糖體生物合成活性增強(qiáng)，成熟的18S和28S rRNA水平升高，導(dǎo)致核糖體蛋白RPL5和RPL11停留在核仁中，從而阻止它們與MDM2結(jié)合。這導(dǎo)致了MDM2介導(dǎo)的p53泛素化和降解的增加。與非腫瘤肝組織相比，HCC組織中SNORA18L5水平升高，且患者生存時間縮短。該研究深入淺出的從中國人口全基因組的生殖拷貝數(shù)的突變?nèi)胧诌M(jìn)一步揭示了CNV的突變通過snoRNA的差異表達(dá)來影響乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝癌。

機(jī)制圖

技術(shù)路線圖

結(jié)果

圖1 

A 通過CNVplex實(shí)驗(yàn)對237例病例組與243對照組患者的14個CNV位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型，只有低拷貝數(shù)的染色體15q13.3位點(diǎn)存活下來; B 熒光原位雜交（FISH）發(fā)現(xiàn)三個拷貝數(shù)的CNV確實(shí)存在于15q13.3位點(diǎn);C 多種族數(shù)據(jù)庫分析以及亞洲人的1000個基因組計劃的數(shù)據(jù)庫分析，15q13.3重復(fù)基于Affymetrix SNP-probe等位基因強(qiáng)度的最大間隔跨度約為614.5 Kb，通過與TCGA數(shù)據(jù)庫中28類腫瘤比較分析，最小重復(fù)區(qū)間被定義為~15.4 Kb的間隔序列，與ENCODE轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果對照，發(fā)現(xiàn)SNORA18L5剛好在 ~15.4 Kb 的結(jié)構(gòu)域；D RT-PCR結(jié)果表明SNORA18L5的表達(dá)與拷貝數(shù)具有相關(guān)性。

圖2 

A SNORA18L5在肝癌細(xì)胞系高表達(dá); B 在腫瘤組織里SNORA18L5啟動子區(qū)H3K4me3表達(dá)上調(diào); C  ChIP-qPCR 實(shí)驗(yàn)利用H3K4me3 抗體，檢測SNORA18L5的 與H3K4me3 具有相關(guān)性; D 加入MLL抑制劑阻礙了H3K4me3富集到SNORA18L5的啟動子區(qū)； E H3K4me3的上調(diào)與AFP等指標(biāo)正相關(guān); F Kaplan-Meier分析SNORA18L5高表達(dá)與肝癌的不良預(yù)后有關(guān)。

圖3

A,B  在L-02 與HepG2過表達(dá)SNORA18L5促進(jìn)細(xì)胞增殖與克隆形成; C SNORA18L5過表達(dá)促進(jìn)小鼠體內(nèi)腫瘤塊的生成；D 免疫組化實(shí)驗(yàn)SNORA18L5促進(jìn)ki-67表達(dá)；E過表達(dá)SNORA18L5促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)化；F過表達(dá)SNORA18L5抑制細(xì)胞凋亡。

圖4 

A SNORA18L5與NPM共定位于細(xì)胞核；B 前體與成熟rRNA引物設(shè)計 C過表達(dá)SNORA18L5促進(jìn)成熟的28S 與18S rRNA的合成；D Northern blotting結(jié)果表明過表達(dá)SNORA18L5促進(jìn)rRNA的合成 加入Act.D能逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果；E 過表達(dá)SNORA18L促進(jìn)單核糖體與多核糖體的合成。

圖5 

A 31位HBV攜帶的肝癌患者的GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)SNORA18L5的表達(dá)與P53富集相;B過表達(dá)SNORA18L5抑制P53以及相關(guān)基因的表達(dá) C 在p53+/+細(xì)胞過表達(dá)SNORA18L5抑制細(xì)胞凋亡，在p53-/-細(xì)胞促進(jìn)了G1/S期轉(zhuǎn)化 D，F(xiàn) p53+/+細(xì)胞克隆形成能力增強(qiáng)；并且在Huh7和p53-null HCC細(xì)胞系Hep3B證實(shí)了SNORA18L5的致瘤性。

圖6 

A 過表達(dá)或者敲低SNORA18L5，p53 mRNA水平不變；B 放線菌酮（CHX）實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)SNORA18L5縮短了P53的半衰期; C 蛋白酶體抑制劑MG132能減SNORA18L5所造成的P53的降解；D SNORA18L5干預(yù)MDM2所導(dǎo)致的P53的泛素化； E 敲低MDM2后P53的表達(dá)不受SNORA18L5的影響

圖7 

A 在HepG2過表達(dá)SNORA18L5使得RPL5與RPL11在胞質(zhì)中表達(dá)降低卻在細(xì)胞核里表達(dá)上調(diào)；B,C在HepG2過表達(dá)SNORA18L5使得MDM2與RPL5以及RPL11的內(nèi)源性的結(jié)合能力減弱；D,E RPL5與RPL11是P53穩(wěn)定性與細(xì)胞增殖所必須的