LncRNA通過自噬保護機制促進癌癥發(fā)生相關(guān)研究策略

有缺陷的自噬被認為有助于包括癌癥等許多疾病的發(fā)病機制。PVT1（plasmacytoma variant translocation 1 ，）是一種致癌的長非編碼RNA，已被鑒定為胰腺導管腺癌的預后生物標志物，但PVT1如何在胰腺導管腺癌（PDA）自噬調(diào)節(jié)中起作用尚不清楚。近日在MOL CANCER（IF=7.776）發(fā)表了題為“LncRNA PVT1 triggers Cyto-protective autophagy and promotes pancreatic ductal adenocarcinoma development via the miR-20a-5p/ULK1 Axis”。研究人員通過定量實時聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和原位雜交（ISH）檢測PVT1表達水平。進行蛋白質(zhì)印跡或qRT-PCR以評估ULK1蛋白質(zhì)或mRNA水平。在共聚焦顯微鏡下通過自噬通量檢測和在透射電子顯微鏡（TEM）下的自噬泡液研究來探索自噬。 PVT1在自噬和PDA發(fā)育中的生物學作用是通過功能獲得和功能喪失測定來確定的。我們發(fā)現(xiàn)PVT1水平與PDA癌組織中的ULK1蛋白平行。 PVT1通過在體外和體內(nèi)靶向ULK1促進細胞保護性自噬和癌細胞生長。此外，高PVT1表達與不良預后相關(guān)。此外，他們發(fā)現(xiàn)PVT1作為“海綿體”調(diào)節(jié)miR-20a-5p，從而影響ULK1的表達和胰腺導管腺癌的發(fā)展。他們的研究表明，“PVT1 / miR-20a 5p / ULK1 /自噬”途徑調(diào)節(jié)胰腺導管腺癌的發(fā)展，可能是開發(fā)胰腺導管腺癌治療策略的新靶點。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1 ULK1蛋白水平和人PDA組織的PVT1表達正相關(guān)。

圖1 ULK1蛋白水平與人PDA組織中PVT1蛋白水平正相關(guān)。

a Western blot分析PDA組織及相應(yīng)的鄰近非腫瘤胰腺標本(n=20)中ULK1蛋白的表達(n=20)。b a的定量。c 20個PDA組織中ULK1 mRNA水平與對應(yīng)的鄰近非腫瘤胰腺標本相比無統(tǒng)計學意義。d 基于qRT-PCR的20例PDA患者PDA組織中PVT1的表達。e 基于ISH分析的PDA組織中PVT1的表達以及不同組中PVT1陽性樣本的百分比。f 20個PDA組織中PVT1 mRNA表達水平與ULK1蛋白表達水平呈正相關(guān)。g qRT-PCR檢測PDA細胞系中PVT1 mRNA水平。h PDA細胞系中PVT1 mRNA表達量與ULK1蛋白表達量呈正相關(guān)。

2 體外驗證PVT1通過上調(diào)ULK1蛋白誘導自噬。

圖2 PVT1對PDA細胞自噬的調(diào)控中起作用。

a PVT1在Capan-2和MIA PaCa-2細胞中通過特異性慢病毒轉(zhuǎn)染過表達. b在SW1990和HPAF-II細胞中，特異性sh-RNAs明顯抑制b PVT1水平。c透射電鏡觀察PVT1在Capan-2和MIA PaCa-2細胞中超微結(jié)構(gòu)是否上調(diào)。d有或沒有下調(diào)PVT1在SW1990和HPAF-II細胞中的超微結(jié)構(gòu)變化。

圖3 有或無PVT1調(diào)節(jié)的GFP-LC3的點狀檢測。

a, b pvt1過表達細胞(Capan-2和MIA PaCa-2)中GFP-LC3 (a)和pvt1 -下調(diào)細胞(SW1990和HPAF-II) (b);PVT1過表達細胞(Capan-2和MIA PaCa-2)中GFP LC3的c、d定量(c)和PVT1下調(diào)細胞(SW1990和HPAF-II) (d)。同時，PVT1的下調(diào)降低了GFP-LC3點狀的數(shù)量。

圖4 PVT1在體外細胞保護自噬和PDA細胞生長中起重要作用。

a MTS測定表明PVT1的上調(diào)增強了Capan-2細胞中的細胞生長。在與自噬抑制劑（3-MA）溫育后觀察到生長受損。同時，PVT1的下調(diào)抑制了HPAF-II細胞中的細胞生長。用自噬誘導劑治療后發(fā)生生長恢復（下）; b克隆形成試驗表明，增加的PVT1表達促進了Capan-2細胞的細胞增殖。然而，3-MA減少了PVT1過表達細胞中的細胞增殖。PVT1表達降低抑制了HPAF-II細胞中的細胞增殖。自噬誘導劑處理后觀察到細胞生長的挽救; c EdU測定細胞增殖; d在Capan-2細胞中過表達PVT1后，有絲分裂S期細胞的百分比增加。與3-MA孵育后發(fā)生百分比降低。 PVT1的表達減少減少了HPAF-II細胞中的S期細胞。自噬誘導劑誘導自噬后發(fā)生S期挽救; e在Capan-2細胞中上調(diào)PVT1后，抑制細胞凋亡。

圖5 PVT1通過調(diào)節(jié)ULK1實現(xiàn)自噬。 

a在有或沒有PVT1上調(diào)的Capan-2和MIA PaCa-2細胞中LC3b的WB分析。 b PVT1下調(diào)后LC3b II表達降低; c在PVT1穩(wěn)定表達的Capan-2和MIA PaCa-2細胞中LC3b的WB分析，敲低 ULK1后檢測到LC3b II表達的抑制; d在PVT1-knowndown SW1990和HPAF-II細胞中恢復ULK1表達后，LC3b II表達被挽救。

3 體內(nèi)驗證PVT1水平對PDA腫瘤生長產(chǎn)生影響。

圖6 抑制PVT1抑制體內(nèi)PDA的生長。

a HPAF-II細胞中PVT1的下調(diào)抑制了體內(nèi)4周后腫瘤的生長(每組n= 5)。b、c生長曲線(b)和腫瘤重量(c)。d、ePVT1表達降低明顯降低PDA腫瘤生長;采用IVIS皮下注射pvt1 -沉默HPAF-II細胞后，異種移植瘤的典型圖像(d)和光子內(nèi)流(e)。f HE染色、TUNEL染色、Ki67、ULK1免疫組化染色; Ki67 (g)、TUNEL (h)和ULK1 (i)的定量。

圖7 PVT1通過吸附miR-20a-5p調(diào)節(jié)ULK1表達。

a軟件預測靶向PVT1 3'UTR和ULK1 3'UTR的microRNA。b PVT1 pull down。cWB分析有或沒有過表達或抑制靶miRNA（miR 20a-5p，miR-302a-3p，miR-17-5p）的HPAF-II細胞中ULK1表達。d進行RIP測定和qRT-PCR，檢測HPAF-II細胞中AGO2抗體對PVT1和miR-20a-5p的富集。e使用TargetScan 預測miR-20a-5p和PVT1結(jié)合位點，使用Starbase預測ULK1 3’UTR 序列中miR-20a-5p結(jié)合位點。f雙熒光素酶測定顯示，共轉(zhuǎn)染psiCHECK-ULK1-WT和miR-20a-5p時， g熒光素酶報告基因測定顯示，用psiCHECK-PVT1-WT和miR-20a-5p共轉(zhuǎn)染; h，miR-20a-5p的qRT-PCR分析。細胞中PVT1表達的增加（h）細胞中PVT1表達的降低（i）; j miR-20a-5p的過表達對PVT1表達水平?jīng)]有貢獻。

4 PVT1在PDA中的表達及其與患者預后呈負相關(guān)。

圖8 PVT1在PDA中上調(diào)，與PDA進展相關(guān)并預測預后。

a，b PDA患者中PVT1的GSE16515（a）和GSE15471（b）數(shù)據(jù)表達譜。 c PVT1在68例PDA患者中的表達。 d與I + II期患者（n = 44）相比，III + IV期患者（n = 24）PVT1表達上調(diào)。e PVT1的高表達預示著68名PDA患者的預后不良。