致命的肥胖——脂肪組織外泌體促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)展

  肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌最常見的病理類型之一，危害大，有多種誘因，肥胖亦被視為導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的重要危險(xiǎn)因素之一，但目前針對肥胖與肝細(xì)胞癌之間關(guān)系的研究還十分的少。今年4月，Dr. Haiyang Zhang等人在雜志《Oncogene》上發(fā)表了一篇題為“Exosome circRNA secreted from adipocytes promotes the growth of hepatocellular carcinoma by targeting deubiquitination-related USP7”的文章，研究者們認(rèn)為脂肪細(xì)胞可以通過分泌外泌體吸收miR-34a并激活USP7/Cyclin A2通路，最終促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，并通過一系列的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了自己的猜想。

摘要：

肝細(xì)胞性肝癌（HCC）是肝癌的主要表現(xiàn)形式，其發(fā)病率不斷上升，且預(yù)后較差。脂肪組織能量儲存和通過分泌脂肪因子調(diào)節(jié)代謝的功能已被熟知。環(huán)狀RNA（circRNA）是一種新型的非編碼RNA，近年來被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)進(jìn)因子，但從脂肪組織中提取的外泌體circRNA的作用尚不明確。在這里，脂肪分泌的circRNA被發(fā)現(xiàn)可在HCC中調(diào)控去泛素化，從而促進(jìn)細(xì)胞生長。研究發(fā)現(xiàn)，在體脂較高的HCC患者中，外泌體環(huán)狀-去泛素化(circ-DB)表達(dá)上調(diào)。此外，體外和體內(nèi)的研究表明exocirc-DB通過抑制miR-34a和激活去泛素化相關(guān)USP7促進(jìn)HCC生長并減少DNA損傷。最終，結(jié)果表明，脂肪外泌體對HCC細(xì)胞的作用可以通過敲除circ-DB逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果顯示脂肪細(xì)胞分泌的外泌體cirRNAs通過抑制miR-34a和激活USP7/Cyclin A2信號通路促進(jìn)腫瘤生長并減少DNA損傷慢性乙型肝炎(HBV)或丙型肝炎(HCV)感染、過度飲酒、免疫相關(guān)肝炎和肥胖通常被認(rèn)為是導(dǎo)致HCC的主要危險(xiǎn)因素。在肝癌細(xì)胞中,miR-34a在β-catenin監(jiān)管中起著至關(guān)重要的作用。然而，miR-34a與circRNA之間的相互作用仍然未知。泛素特異性蛋白酶7 (USP7)是一種去泛素化酶，在細(xì)胞周期、增殖、DNA修復(fù)等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。高水平的USP7常出現(xiàn)在HCC組織中，這與腫瘤的生長和侵襲有關(guān)，導(dǎo)致總體生存率較低。USP7抑制劑P5091誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)生長停滯和凋亡。在肝細(xì)胞腫瘤發(fā)生過程中，泛素特異性蛋白酶驅(qū)動細(xì)胞周期的發(fā)展。 近年來的研究表明，Cyclin A2是USP7的重要下游底物，活躍的USP7/Cyclin A2信號通路可以促進(jìn)乳腺癌的生長。
一、HCC中exo-circ-DB和USP7的表達(dá)模式

  從HCC患者和正常受試者(NC)的血漿中分離出外泌體。利用western blot尋找外泌體特異性標(biāo)志物，將患者分組，檢測USP7表達(dá)水平，采用RT-qPCR檢測外泌體中circ-DB的表達(dá)水平，并結(jié)合WB和灰色分析對USP7蛋白進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)表明，體脂比較高的HCC患者外泌體circ-DB上調(diào)，且circ-DB與USP7表達(dá)呈正相關(guān)。

Fig. 1 HCC中exo-circ-DB和USP7的相關(guān)性研究。 a 從人血漿中分離的外泌體透射電鏡（TEM）圖像(比例尺，100 nm)。 b 從正常受試者(NC)和HCC患者中分離血漿外泌體。三種代表性外泌體特異性標(biāo)志物的Western blotting結(jié)果：CD63, Alix和Tsg101。 c 用NAT分析檢測血漿外泌體的大小范圍。 d 根據(jù)HCC患者體脂比例中位數(shù)，將HCC患者分為中位以上組(n = 21)和中位以下組(n = 19)。 e 使用安捷倫芯片微陣列掃描儀初步篩選HCC的circ-RNA (n = 21 ，n = 19)。 f, g 中位數(shù)以上組和中位數(shù)以下組USP7的WB分析(n = 21, n = 19)。 h circ-DB與USP7之間潛在相互作用的代表性圖像。 i 預(yù)測miR-34a在USP7 mRNA中的結(jié)合區(qū)域。 j 血漿exo-circ-DB與USP7蛋白的臨床相關(guān)性(n = 21)。 **p < 0.01
二、exo-circ-DB、miR-34a和USP7的臨床相關(guān)性

 通過免疫組化法(IHC)檢測癌旁組織(P)和腫瘤組織(T)中USP7的表達(dá)，利用PT-PCR檢測各組circ-DB表達(dá)量，檢測各組中miR-34a和USP7的表達(dá)。數(shù)據(jù)表明，血漿外泌體circ-DB在中位以上組上調(diào)，與miR-34a和USP7在HCC中的表達(dá)密切相關(guān)。

Fig. 2 HCC中exo-circ-DB、miR-34a和USP7的臨床相關(guān)性. a 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法(IHC)檢測癌旁組織(P)和腫瘤組織(T)中USP7的表達(dá)。比例尺，100 μm。 b 根據(jù)USP7 mRNA的平均值將HCC患者分為兩組。USP7的表達(dá)與HCC的生存密切相關(guān)（高組中n = 1595，低組中n = 2356）。 c–e 中位以上組和中位以下組中exo-circ-DB、腫瘤組織中miR34a和腫瘤組織中USP7的水平（n = 21，n = 19）。f, g exo-circ-DB與miR-34a呈負(fù)相關(guān)(n = 21, R = 0.735)，miR-34a與USP7呈負(fù)相關(guān)(n = 21, R = 0.762)。 **p < 0.01
三、miR-34a與USP7的直接相互作用

  miR-34a被認(rèn)為是與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和生存相關(guān)的癌癥相關(guān)基因的調(diào)控因子。USP7是預(yù)測出的高可信靶點(diǎn)之一。研究者使用miRNA模擬物被用來過表達(dá)miR-34a, 使用miRNA抑制劑來抑制miR-34a的表達(dá)。使用生物素標(biāo)記的miR-34a進(jìn)行免疫沉淀，以確定miR-34a是否直接與USP7相互作用。通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明miR-34a對 USP7的調(diào)控作用。結(jié)果表明miR-34a直接抑制USP7, Cyclin A2是USP7的重要下游底物。

Fig. 3 驗(yàn)證USP7在HCC細(xì)胞中作為miR-34a的直接靶點(diǎn)以及Cyclin A2的靶點(diǎn)。a miR-34a和USP7可能的結(jié)合位點(diǎn)。 b miR-34a水平的RT-PCR分析（n = 3）。 c 被biotin-miR-34a捕獲的USP7 mRNA的RT-qPCR分析 (n = 3)。d miR-34a直接識別USP7（n = 3）。含有野生型(WT)或突變型(Mut) USP7的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因，將miR-34a模擬物和相關(guān)正常對照物共轉(zhuǎn)染293個T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后檢測相對熒光素酶水平(n = 3)。 e–g WB顯示了miR-34a模擬物或miR-34a抑制劑治療的HCC細(xì)胞中USP7和cyclin A2的表達(dá)水平(n = 3)。 h RT-PCR定量檢測相應(yīng)的USP7和cyclin A2表達(dá)(n = 3)。i, j 當(dāng)USP7過表達(dá)或被siRNA抑制時，Cyclin A2的表達(dá)水平(n = 3)。 **p < 0.01
四、脂肪細(xì)胞外泌體對肝癌細(xì)胞miR-34a、USP7和Cyclin A2的影響

  研究者利用透射電鏡觀察3T3L1細(xì)胞外泌體的形態(tài)，檢測3T3L1細(xì)胞中CD63、Alix和tsg10的表達(dá)量。用成熟脂肪細(xì)胞分泌的外泌體處理HCC細(xì)胞，檢測miR-34a、USP7和cyclin A2水平。將circ-DB的siRNA轉(zhuǎn)染到3T3L1細(xì)胞中以去除外泌體中的circ-DB，轉(zhuǎn)染48小時后收集外泌體。由結(jié)果可知，脂肪細(xì)胞外泌體作為exo-circ-DB的載體，上調(diào)USP7和cyclin A2。

Fig. 4 miR-34a、USP7和Cyclin A2的表達(dá)受脂肪細(xì)胞外泌體調(diào)控。 a 3T3L1外泌體的透射電鏡圖像(比例尺，100 nm)。b WB檢測CD63、Alix、Tsg101表達(dá)。c 成熟脂肪細(xì)胞和脂肪前體細(xì)胞的油紅O染色。d, e circ-DB在成熟和前體脂肪細(xì)胞(d)以及3T3L1細(xì)胞外泌體(e)中的表達(dá)差異(n = 3)。f 成熟脂肪細(xì)胞外泌體治療HCC細(xì)胞的圖示。 g–i miR-34a在成熟脂肪細(xì)胞外泌體治療的HCC細(xì)胞中的定量表達(dá)以及USP7和cyclin A2的表達(dá)水平 (n = 3)。**p < 0.01

五、circ-DB與miR-34a的相關(guān)性

  通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步揭示了circ-DB與miR-34a的直接聯(lián)系，構(gòu)建含有mir-34a結(jié)合區(qū)1或2的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，每個質(zhì)粒包含一個mir-34a結(jié)合區(qū)域。將含有mir-34a結(jié)合位點(diǎn)（mut）逆序序列的質(zhì)粒作為陰性對照。然后使用WB檢測USP7和Cyclin A2的表達(dá)水平以進(jìn)一步評價circ-DB對USP7或Cyclin A2的影響。

Fig. 5 circ-DB調(diào)控miR-34a/USP7/Cyclin A2通路。a, b miR-34a在circ-DB中的兩個預(yù)測結(jié)合區(qū)域。c, d 通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-34a與circ-DB之間的相互作用(n = 3)。e circ-DB的RT-PCR定量或circ-DB siRNA的抑制作用。f 細(xì)胞經(jīng)circ-DB-OE質(zhì)粒和circDB siRNA處理后的miR-34a水平。g, h 用circ-DB-OE質(zhì)粒和circDB處理的成熟脂肪細(xì)胞中USP7和Cyclin A2的表達(dá)水平(n = 3)。i 用circ-DB-OE質(zhì)粒和circ-DB siRNA (f)處理的3T3L1細(xì)胞中USP7的定量(n = 3) **p < 0.01，***p < 0.001

六、 脂肪exo-circ-DB促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長，抑制DNA損傷

研究者檢測了脂肪來源的外泌體對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。隨后，將circ-DB過表達(dá)質(zhì)粒和circ-DB siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，進(jìn)一步揭示circ-DB在HCC中的生物學(xué)作用。由結(jié)果可知脂肪外泌體通過傳遞circ-DB促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，減少DNA損傷。

Fig. 6 外泌體circ-DB促進(jìn)腫瘤生長，減少DNA損傷。用3T3 exo或circDB被circ-DB siRNA去除的3T3 exo預(yù)處理HCC細(xì)胞。a, b 用Edu實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖(n = 3)。c, d用transwell法測定細(xì)胞遷移(n = 3)。e, f DNA損傷評估(n = 3)。**p < 0.01

Fig. 7 circ-DB和USP7在肝癌細(xì)胞增殖和DNA損傷調(diào)控中的作用。用circ-DB過表達(dá)質(zhì)粒（OE.circ-DB）預(yù)處理HCC細(xì)胞，用circDB siRNA（si.circ-DB）去除circ-DB siRNA。a, b 用DAPI和EdU對細(xì)胞進(jìn)行染色，核成像顯示肝癌細(xì)胞的增殖(n = 3)。c, d 用DAPI和H2AFX進(jìn)行細(xì)胞染色，然后核成像(n = 3)。用USP7過表達(dá)質(zhì)粒（OE.USP7）和USP7 siRNA （si.USP7）預(yù)處理HCC細(xì)胞。e, f 用DAPI和EdU對細(xì)胞進(jìn)行染色，然后核成像顯示HCC細(xì)胞的增殖情況(n = 3)。g, h 用DAPI和H2AFX染色細(xì)胞，然后核成像 (n = 3)。**p < 0.01

七、USP7介導(dǎo)HCC中cyclin A2去泛素化

  Cyclin A2是Cyclin家族成員之一，在S期促進(jìn)DNA合成，促進(jìn)細(xì)胞周期從G2期向M期過渡。Cyclin A2功能障礙與細(xì)胞錯誤增殖和染色體不穩(wěn)定有關(guān)。

研究者通過結(jié)合cyclin A2免疫沉淀和UB WB，研究USP7在介導(dǎo)cyclin A2去泛素化過程中的作用；加載HCC細(xì)胞總蛋白來檢測cyclin A2的表達(dá)，利用cyclin A2抗體拉低的免疫沉淀分析cyclin A2的泛素化。

總結(jié)得到的結(jié)果，可知USP7通過降低包括cyclin A2在內(nèi)的多種蛋白的泛素化而發(fā)揮致癌基因的作用。

Fig. 8 Exo-circ-DB和USP7調(diào)控cyclin A2的去泛素化。按上述方法處理HCC細(xì)胞，免疫沉淀法分析其泛素化水平。a 3T3外泌體處理的HCC細(xì)胞中Cyclin A2泛素化的WB分析（n = 3）。 b 用USP7質(zhì)?；騏SP7 siRNA處理的肝癌細(xì)胞中Cyclin A2泛素化的WB分析（n = 3）。c circ-DB質(zhì)?；騝irc-DB siRNA處理的HCC細(xì)胞中Cyclin A2泛素化的WB分析（n = 3）。d miR-34a模擬物或miR-34a抑制劑處理的HCC細(xì)胞中Cyclin A2泛素化的WB分析（n = 3）。**p < 0.01
八、    circ-DB在體內(nèi)增強(qiáng)腫瘤生長，提高體脂比

  將腫瘤植入小鼠，觀察脂肪細(xì)胞分泌的外泌體circRNA對體內(nèi)腫瘤生長的影響。用慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞(Hepa1-6細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染序列為circDB過表達(dá)(circ-DB-OE)或circ-DB shRNA (circ-DB-KD)。C57小鼠和ob/ob小鼠皮下植入肝細(xì)胞腫瘤細(xì)胞，PBS作為陰性對照。第28天處死小鼠，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

  分析數(shù)據(jù)可知脂肪來源的外泌體可以在體內(nèi)將circ-DB導(dǎo)入HCC腫瘤，脂肪分泌的circ-DB促進(jìn)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

Fig. 9 a 外泌體circ-DB對小鼠肝癌模型的影響。按原理圖描述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建動物模型。 b 從小鼠血漿中分離的外泌體TEM照片。c 外泌體標(biāo)記物的WB分析。d 未經(jīng)處理的C57和ob/ob小鼠的血清外泌體中circ-DB的定量(n = 6)。e f C57小鼠(e)或ob/ob小鼠(f)血清外泌體中circ-DB的相對水平(n = 6)。g 腫瘤組織中circ-DB的相對水平(n = 6)。h 6組腫瘤照片(n = 6)。i–l 各組的腫瘤重量、小鼠體重、體脂比、肝轉(zhuǎn)移數(shù)(n = 6)。 **p < 0.01

九、    circ-DB/miR-34a/USP7軸在小鼠腫瘤組織中的表達(dá)模式

  這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明circ-DB在HCC腫瘤中作為miR-34a海綿發(fā)揮作用，miR-34a下調(diào)激活USP7/cyclin A2，導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)。

結(jié)果：

  綜上所述，本研究證實(shí)脂肪細(xì)胞分泌的外泌體circRNA通過吸收miR-34a并激活USP7/Cyclin A2通路，在促進(jìn)HCC腫瘤生長方面發(fā)揮重要作用。這些發(fā)現(xiàn)為理解脂肪組織和肝細(xì)胞癌之間的關(guān)系提供了深入的見解。