circTRIM33-12與肝細(xì)胞癌之間的聯(lián)系大揭秘

近年來，環(huán)狀RNA（circRNA）在包括肝癌在內(nèi)的癌癥的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而，大多數(shù)環(huán)狀RNA在肝細(xì)胞癌（HCC）中的作用仍不清楚。
今天小編帶大家了解近期發(fā)表于Molecular Cancer上的一篇關(guān)于環(huán)狀RNA circTRIM33-12通過海綿化MiR-191抑制肝癌的發(fā)展的文章Circular RNA circTRIM33-12 acts as the sponge of MicroRNA-191 to suppress hepatocellular carcinoma progression。

肝細(xì)胞癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。HCC的臨床特點(diǎn)是侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，治療機(jī)會有限。目前肝細(xì)胞癌最常見的治療方式是手術(shù)治療，但多焦點(diǎn)發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)使大多數(shù)肝細(xì)胞癌不能手術(shù)治療；因此，進(jìn)一步了解HCC發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。本文通過一系列實(shí)驗(yàn)評估了circTRIM33-12在HCC發(fā)展中的作用，進(jìn)而證明環(huán)狀RNA circTRIM33-12通過海綿化MiR-191抑制肝癌的發(fā)展。
技術(shù)路線：
研究者的實(shí)驗(yàn)思路如下：

結(jié)果：     
1.TRIM33來源的circTRIM33-12在HCC中的調(diào)節(jié)     
TRIM33是一種腫瘤抑制因子，可以通過不同的機(jī)制抑制包括HCC在內(nèi)的多種癌癥的腫瘤細(xì)胞進(jìn)展和腫瘤發(fā)生。先前研究報(bào)道TRIM33在HCC中的下調(diào)是由TRIM33啟動子CpG的高甲基化引起的，表明circRNA來源的TRIM33在HCC細(xì)胞中表達(dá)可能下調(diào)。因此，我們推測來源circRNA的TRIM33有可能在HCC細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。為了研究TRIM33來源的circRNA在HCC組織中的表達(dá)，我們使用qRT-PCR分析了四對HCC組織樣本。我們發(fā)現(xiàn)，在18個(gè)circRNAs中，有4個(gè)HCC腫瘤組織中circTRIM33-12的表達(dá)顯著且持續(xù)下降（圖1a）。因此，我們將重點(diǎn)放在circTRIM33-12（circRNA源自TRIM33的12和18外顯子）的表達(dá)和作用上（圖1b）。為了進(jìn)一步探討circTRIM33-12在HCC患者中的表達(dá)對預(yù)后的影響，我們使用qRT-PCR對200例HCC及鄰近組織中circTRIM33-12的表達(dá)水平進(jìn)行了定量分析(圖1c)。結(jié)果顯示，與來自同一患者的鄰近組織的circTRIM33-12表達(dá)水平相比，58%（116/200）的HCC組織的circTRIM33-12表達(dá)水平顯著降低。選取200例HCC組織中circTRIM33-12的中間相對表達(dá)量作為腫瘤分離的分界點(diǎn)。Kaplan-Meier生存分析顯示，circTRIM33-12表達(dá)水平低的患者臨床預(yù)后較差（圖1d和e）。這些數(shù)據(jù)提示HCC細(xì)胞中circTRIM33-12表達(dá)的減少與患者預(yù)后不良有關(guān)，提示circTRIM33-12表達(dá)的減少可能參與了HCC的進(jìn)展。

2.circTRIM33 12抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲     
接下來，研究circTRIM33-12在HCC進(jìn)展中的生物學(xué)功能。CCK-8測定、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)circTRIM33-12后，SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移受到顯著抑制(圖2a-c)。為了進(jìn)一步探討circTRIM33-12在體內(nèi)的作用，我們應(yīng)用過表達(dá)circTRIM33-12 的SMMC-7721細(xì)胞和模擬對照細(xì)胞建立原位植入肝內(nèi)HCC模型。circtrim33-12過表達(dá)組與模擬對照組相比，SMMC-7721異種移植原位生長4周后，腫瘤的規(guī)格更小(圖2d)。與這些預(yù)期一致，與SMMC-7721異種移植的模擬對照組相比，circtrim33-12過表達(dá)組的肺組織轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)減少(圖2e)。

     
3.circTRIM33-12可以通過海綿化miR-191發(fā)揮作用   
鑒于環(huán)狀RNA已被證明在癌細(xì)胞中充當(dāng)miRNA海綿的作用，我們探討了circTRIM33-12是否能在HCC進(jìn)展中與某些miRNA結(jié)合。
首先，我們用抗AGO2抗體在Huh 7細(xì)胞中進(jìn)行RIP。結(jié)果顯示，環(huán)狀RNA circTRIM33-12被AGO2抗體顯著富集(圖3a），表明circTRIM33-12可能是AGO2與miRNAs結(jié)合的平臺。接下來，我們使用StarBase v2.0目標(biāo)預(yù)測工具找到11個(gè)可能與circTRIM33-12結(jié)合的miRNAs。根據(jù)最近的研究，這些miRNAs中有3個(gè)作為致癌基因，包括miR-23a-3p、miR-191和miR-224-5p。為了進(jìn)一步鑒定與circTRIM33-12結(jié)合的miR-23a-3p、miR-191和miR-224-5p，我們構(gòu)建了含有熒光素酶基因的circTRIM33-12表達(dá)質(zhì)粒載體，并將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到Huh 7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，我們觀察到3個(gè)miRNAs，尤其是miR-191，熒光素酶活性水平降低(圖3b和c)。此外，使用生物素標(biāo)記的miR-191模擬物進(jìn)行的pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照相比，circTRIM33-12顯著富集(圖3d)。然而，在HCC Huh 7細(xì)胞中miR-191模擬表達(dá)增加或減少后，circTRIM33-12并沒有顯示出明顯的變化(圖3e)，而在HCC SMMC-7721或Huh 7細(xì)胞中，當(dāng)circTRIM33-12表達(dá)被強(qiáng)制表達(dá)或敲除后，miR-191均未表現(xiàn)出顯著變化(圖3f)。這些結(jié)果表明，circTRIM33-12和miR-191可能不會相互降解。這些實(shí)驗(yàn)表明circTRIM33-12可能通過海綿化miR-191發(fā)揮作用。

4.circTRIM33 12通過海綿化miR-191上調(diào)TET1表達(dá)   
已有研究報(bào)道m(xù)iR-191在人類癌癥中直接靶向多種基因，包括TET1、TIMP3、SATB1和DIECR1。然而，我們沒有檢測到這些mRNAs在轉(zhuǎn)染miR-191模擬物的Huh 7細(xì)胞或轉(zhuǎn)染miR-191 siRNA的SMMC-7721細(xì)胞中顯著表達(dá)。有趣的是，除了TET1蛋白的表達(dá)外，我們也沒有檢測到在miR-191過表達(dá)/敲減細(xì)胞中這些蛋白顯著表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)circTRIM33-12對TET1表達(dá)的影響，我們用circTRIM33-12質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，用qRT-PCR和western blotting檢測TET1 mRNA和蛋白水平。結(jié)果表明,circTRIM33-12的異位表達(dá)顯著增加TET1蛋白表達(dá)(圖4a和圖4b)。相反，circTRIM33-12的擊倒的顯著降低TET1蛋白質(zhì)表達(dá)(圖4c和圖4d)。熒光素酶活性測定表明，circTRIM33-12的擊倒可以有效降低wt的熒光素酶活性，而miR-191對Huh 7細(xì)胞中circTRIM33-12敲除引起的熒光素酶活性的抑制作用可以通過抑制miR-191恢復(fù)(圖4e和f)。此外，強(qiáng)迫表達(dá)circTRIM33-12可以有效提高wt細(xì)胞的熒光素酶活性(圖4f)。最后，我們使用qRT-PCR和IHC檢測了200例HCC患者組織中TET1的表達(dá)。在HCC患者中，circTRIM33-12與TET1呈顯著正相關(guān)(圖4g和圖h)。

5.circTRIM33 12和TET1負(fù)責(zé)調(diào)控5hmC的表達(dá)     
為了檢測改變的circTRIM33-12或TET1表達(dá)是否可以在HCC細(xì)胞中調(diào)控DNA甲基化水平，我們首先比較了mock、circTRIM33-12 或TET1過表達(dá)的SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞的中的5mC和5hmC表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)在circTRIM33-12和TET1過表達(dá)的細(xì)胞中5 hmc的表達(dá)水平顯著增加(圖5a和圖5b)。生長曲線顯示，與模擬組相比，TET1顯著抑制細(xì)胞增殖(圖5c)。此外，在細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中，與模擬組相比，TET1減少了S期的細(xì)胞數(shù)量(圖5d)。通過體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，探討TET1是否抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。發(fā)現(xiàn)除circTRIM33-12外，與模擬組相比，TET1顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲(圖5e)。這些數(shù)據(jù)證明circTRIM33-12可以通過海綿化miR-191抑制HCC進(jìn)展，從而通過circTRIM33-12 /miR-191/TET1軸抑制miR-191致癌效應(yīng)。

6.TET1負(fù)調(diào)控癌基因表達(dá)，與免疫逃避有關(guān)
為了研究circTRIM33-12是否通過miR-191/TET1軸發(fā)揮其生物學(xué)功能，我們檢測了在circTRIM33-12或TET1敲減和過表達(dá)的HCC細(xì)胞中WWC3、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的表達(dá)。結(jié)果顯示circTRIM33-12或TET1的沉默均顯著降低了HCC Huh 7細(xì)胞中WWC3、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的mRNA和蛋白表達(dá)水平（圖6a）。此外，過表達(dá)circTRIM33-12或TET1可提高HCC SMMC-7721細(xì)胞中WWC3、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的mRNA和蛋白表達(dá)水平（圖6b）。為了驗(yàn)證WWC3、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNAs的3 ' UTR是否為miR-191在HCC細(xì)胞中的靶基因，我們采用熒光素酶報(bào)告基因檢測。將WWC3、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的3 ' UTR序列克隆到熒光素酶報(bào)告載體中。miR-191模擬物在3 ' UTR序列轉(zhuǎn)染的Huh 7細(xì)胞中不抑制熒光素酶活性（圖6c）。這些結(jié)果表明，在HCC細(xì)胞中，WWC3、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mrna并不是miR-191的靶點(diǎn)。
激活受體自然殺傷組2D（NKG2D）及其配體成員在介導(dǎo)癌癥的免疫反應(yīng)的NK細(xì)胞、γδ+ T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。NKG2D可以識別人類體內(nèi)八種不同的配體，包括ULBP1。阻止癌癥進(jìn)展的重要機(jī)制之一是對癌細(xì)胞的免疫監(jiān)測，其中NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用。為了進(jìn)一步探討circTRIM33-12與免疫逃避的關(guān)系，我們檢測了200例HCC組織和匹配的非腫瘤組織中NKG2D的表達(dá)。與鄰近非腫瘤組織相比，HCC組織中NKG2D陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（156/200；2倍）（圖6d）。散點(diǎn)分析顯示circTRIM33-12表達(dá)與HCC組織中NKG2D陽性細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)（R2 = 0.1193；P < 0.001；圖6 e）。這些結(jié)果表明circTRIM33-12可能通過海綿化miR-191保護(hù)TET1發(fā)揮其抗腫瘤作用。

7.miR-191的沉默逆轉(zhuǎn)了circTRIM33-12的下調(diào)，并誘導(dǎo)了HCC細(xì)胞的進(jìn)展
接下來我們探討miR-191的沉默是否影響circTRIM33-12敲減的HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。通過qRT-PCR檢測沉默效率(圖7a)。正如預(yù)測，miR-191的沉默上調(diào)TET1蛋白的表達(dá)，但不上調(diào)circTRIM33-12敲減的Huh 7 MHCC97L細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)（圖7b和圖7c）。此外，在CCK-8和遷移實(shí)驗(yàn)中，miR-191的沉默顯著抑制Huh和MHCC97L細(xì)胞系的增殖、遷移和入侵的能力（圖7d）?？傊@些結(jié)果表明，circTRIM33-12通過circTRIM33-12 /miR-191/TET1軸抑制HCC細(xì)胞的進(jìn)展。