類風(fēng)濕與腸道菌群不可告人的秘密

腸道菌群近年來逐漸成為研究熱點(diǎn)，并在許多生命過程中發(fā)揮著重要的作用，例如參與自身免疫進(jìn)程，與神經(jīng)發(fā)育的聯(lián)系。近期，微生物頂級(jí)期刊Microbiome發(fā)表了一篇題名為：單一細(xì)菌種恢復(fù)微生物生態(tài)失調(diào)，保護(hù)大鼠模型骨骼免受類風(fēng)濕破壞的文章。該文章主要通過宏基因組鳥槍法測(cè)序和宏基因組關(guān)聯(lián)研究，評(píng)估了干酪乳桿菌對(duì)佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型腸道微生物群和免疫功能紊亂的影響。

   對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者進(jìn)行早期治療是優(yōu)化藥物治療成功的關(guān)鍵，目前在關(guān)節(jié)炎前期階段阻斷骨質(zhì)破壞進(jìn)展的治療效果仍然不能令人滿意。RA患者的微生物紊亂通過有效干預(yù)治療顯著逆轉(zhuǎn)。將異常腸道微生物組調(diào)節(jié)到健康狀態(tài)是預(yù)防骨損傷的潛在治療方法。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.干酪乳桿菌顯著減輕佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎
  對(duì)SD大鼠灌喂干酪乳桿菌菌株ATCC334和甲氨蝶呤(MTX)，在同一天用完全弗氏佐劑（CFA）進(jìn)行關(guān)節(jié)炎造模。經(jīng)過三十天干預(yù)后，用干酪乳桿菌和MTX治療的大鼠表現(xiàn)出較少的癥狀加劇。此外，干酪乳桿菌發(fā)揮其抗關(guān)節(jié)炎作用而不遷移到腸道以外的地方，因?yàn)楦衫胰闂U菌是兼性厭氧細(xì)菌，并且在干酪乳桿菌處理的動(dòng)物中未檢測(cè)到菌血癥。通過微型CT發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌處理的大鼠的踝部的骨侵蝕減少，膝關(guān)節(jié)的組織切片觀察結(jié)果與微型CT一致，并且干酪乳桿菌處理的大鼠膝關(guān)節(jié)的病理評(píng)分和踝關(guān)節(jié)的放射學(xué)評(píng)分顯著改善。這些數(shù)據(jù)表明，干酪乳桿菌的給藥能夠減輕實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎并保護(hù)骨骼免受侵蝕。

Fig1.干酪乳桿菌減輕佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎。顯示干酪乳桿菌對(duì)關(guān)節(jié)炎評(píng)分（a）和增加的后爪體積（b）的影響（每組n = 7）。a和b的數(shù)據(jù)被示為平均值±SEM，不同組的數(shù)據(jù)通過雙向ANOVA分析組間差異（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 VS模型）。腳踝的照片，X射線和微CT圖像顯示在c中。在d中顯示了不同組中大鼠膝關(guān)節(jié)病理切片的代表性圖像。通過病理學(xué)評(píng)分e評(píng)估病理結(jié)果。分別使用micro-CT圖像和micro-CT分析儀評(píng)估放射學(xué)評(píng)分和微CT評(píng)分（f，g）。在數(shù)據(jù)e，f，和g被示為平均值±SEM，組之間的差異通過單向ANOVA進(jìn)行分析。（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 VS模型）。骨破壞水平的積分評(píng)估顯示在（h）。數(shù)據(jù)顯示為平均值并分為幾個(gè)級(jí)別。0-0.2：正常; 0.2-0.4：輕微（Lig）; 0.4-0.6：中等（Mod）; 0.6-0.8：嚴(yán)重（Sev）; 0.8及以上：非常嚴(yán)重。正常，正?？刂? 模型，疾病控制; MTX，甲氨蝶呤
2.干酪乳桿菌可預(yù)防由關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)引起的腸道生態(tài)失調(diào)
   由于缺乏明確定義的RA相關(guān)微生物群特征，因此選取五個(gè)時(shí)間點(diǎn)（TP）收集了四組的糞便樣本，并通過使用鳥槍法宏基因組測(cè)序確定了關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中微生物組的動(dòng)態(tài)變化。五個(gè)TP包括第0天，AIA誘導(dǎo)前（TP1），第7天（關(guān)節(jié)炎前時(shí)間點(diǎn)）（TP2），第14天（TP3），第21天（TP4）和第30天（TP5）。在TP3，表明干酪乳桿菌可以在早期補(bǔ)救揮發(fā)性腸道生態(tài)失調(diào)。在TP5，伴隨著在干酪乳桿菌組中觀察到的關(guān)節(jié)炎的緩解，腸道微生物組的組成顯著接近HP而不是DP表明關(guān)節(jié)炎中的生態(tài)失調(diào)可以被干酪乳桿菌逆轉(zhuǎn)，最終有助于改善腸道菌群。關(guān)節(jié)炎評(píng)分與HP的距離呈正相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)= 0.48，P = 0.015），與DP的距離呈負(fù)相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)= -0.46，P = 0.019）。

Fig2.隨著時(shí)間的推移，干酪乳桿菌 / MTX處理的大鼠腸道微生物群組成的動(dòng)態(tài)變化。顯示了在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)于干酪乳桿菌/ MTX處理的大鼠的每個(gè)樣品的健康平面（HP）和模型平面（DP）的距離。線條的顏色對(duì)應(yīng)于不同的樣品，厚度反映了關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。通過配對(duì)t檢驗(yàn)分析HP和DP之間的差異
3.干酪乳桿菌治療佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（AIA）大鼠中紊亂的微生物組
  選擇了25種微生物，其中毛螺菌，奇異變形桿菌和棒狀桿菌支原體已發(fā)現(xiàn)可能與RA相關(guān)。通過標(biāo)準(zhǔn)化處理所鑒定的25種微生物的相對(duì)豐度，然后與TP1相比，在每個(gè)TP處顯示Log10倍數(shù)的變化。
  進(jìn)一步研究了干酪乳桿菌處理的AIA大鼠中關(guān)節(jié)炎相關(guān)菌種的改變。與模型組中的大鼠不同，包括不動(dòng)桿菌，干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的微生物群被上調(diào)，并且解脲支原體，脫硫弧菌和二硫化嗜血桿菌細(xì)菌被下調(diào)。值得注意的是，這些改變發(fā)生在干酪乳桿菌ATCC334沒有持續(xù)定植的情況下，因?yàn)槲覀儧]有檢測(cè)到從干酪乳桿菌處理的大鼠分離的糞便樣品中干酪乳桿菌的富集。然而，其他乳酸桿菌種類相對(duì)豐度上調(diào)或恢復(fù)到正常水平，這表示干酪乳桿菌在抑制關(guān)節(jié)炎中的功能與其調(diào)節(jié)微生物組，特別是其他乳桿菌菌株的功能密切相關(guān)。

Fig3.Log10與TP1的樣品進(jìn)行比較關(guān)節(jié)炎相關(guān)物種中的TP5的相對(duì)豐度的倍數(shù)變化?？虮硎镜谝缓偷谌姆治粩?shù)之間的中位數(shù)和四分位數(shù)間（IQR）; 胡須代表從第一或第三四分位數(shù)的1.5倍IQR內(nèi)的最低值或最高值。圓圈代表樣本。重要的倍數(shù)變化標(biāo)有星號(hào)
4.抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)與受干酪乳桿菌給藥影響的細(xì)菌的豐度相關(guān)
  細(xì)胞因子在RA的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，因此，確定血清中IFN-γ，TNF-α和IL-1β，IL-17，IL-2和IL-6的水平并確定干酪乳桿菌治療AIA大鼠后促炎細(xì)胞因子水平與腸道微生物群改變的相關(guān)性。結(jié)果顯示，與造模組AIA相比，干酪乳桿菌處理的AIA大鼠中促炎細(xì)胞因子IFN-γ，TNF-α，IL-1β，IL-17和IL-6的水平顯著降低。干酪乳桿菌處理的動(dòng)物中，分別由活化的適應(yīng)性和先天性免疫細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17和IL-1β水平顯著降低。這些結(jié)果表明干酪乳桿菌對(duì)AIA大鼠的作用與治療相關(guān)微生物對(duì)促炎細(xì)胞因子表達(dá)的抑制作用相關(guān)。

Fig4.干酪乳桿菌通過嗜酸乳桿菌的復(fù)活抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。a使用ELISA評(píng)估血清中細(xì)胞因子（IL-17，IL-1β，TNFα，IL-6，IFN-γ，IL-2）的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示為平均值±sem和min，max。通過單向ANOVA分析組之間的差異。（* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001 VS模型）。b 嗜酸乳桿菌豐度與血漿細(xì)胞因子的關(guān)系。cc，Spearman在調(diào)整體重，組和關(guān)節(jié)炎評(píng)分后的相關(guān)系數(shù)
5. 干酪乳桿菌保持氧化還原平衡參與AIA大鼠RA的改善
  為了探索干酪乳桿菌給藥有益效果背后的潛在機(jī)制，使用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)L. casei和MTX處理的大鼠的腸道微生物組中的功能模塊進(jìn)行了綜合分析。與微生物群的改變導(dǎo)致宿主代謝和氧化還原平衡變化的觀點(diǎn)一致，發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖途徑的功能模塊，包括氧化階段，在AIA大鼠中得到增強(qiáng)，這與先前有關(guān)RA患者報(bào)告的結(jié)果一致。用干酪乳桿菌治療后，磷酸戊糖途徑中涉及的豐富基因減少，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）醌氧化還原酶，同化硫酸鹽還原，NADH泛醌氧化還原酶，β-氧化和脂肪酸生物合成模塊中涉及的豐度基因增加，表明干酪乳桿菌通過調(diào)節(jié)免疫代謝和氧化還原能力發(fā)揮其抗關(guān)節(jié)炎作用。

Fig5.干酪乳桿菌維持氧化應(yīng)激的氧化還原平衡。與來自MTX，干酪乳桿菌和模型組的TP1樣品相比，TP5處免疫相關(guān)KEGG模塊的豐度的平均log 2倍變化。KEGG orthology group模塊和組按無監(jiān)督層級(jí)聚類排序。青色，減少模塊; 紅色，增加模塊。未繪制一個(gè)或多個(gè)組中缺少的模塊
結(jié)論
      通過在AIA大鼠中使用時(shí)間序列研究方案來鑒定腸道微生物組的組成和功能改變，并且結(jié)果支持調(diào)節(jié)微生物群可以作為預(yù)防和治療人類RA的新策略的結(jié)論。這些結(jié)果是在實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中獲得的，并且非常需要在RA患者中進(jìn)行深入研究。必須進(jìn)一步闡明益生菌的預(yù)防/治療作用背后的精確分子機(jī)制，并且需要對(duì)腸中鑒定的細(xì)菌標(biāo)記物進(jìn)行集中驗(yàn)證。這為RA研究和治療提供了新的研究方向和治療思路。