新生物信息技術(shù)-EISA：解析轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程對基因表達變化所起的作用

分裂分析(EISA)是一種生物信息技術(shù)，通過對RNA-Seq的分析，將轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后效應(yīng)分離開來，并將其映射到外顯子和內(nèi)含子?？蓽y量在不同條件下mRNA和前體RNA水平的變化，可以區(qū)分轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的RNA或在轉(zhuǎn)錄后水平——miRNA成熟或正在降解。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT)是一個備受關(guān)注的課題，認識其機制有助于研究腫瘤轉(zhuǎn)移和藥物敏感性等問題。雖然EMT受許多miRNAs和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，然而miRNAs和轉(zhuǎn)錄因子的功能很難區(qū)分，一部分原因是從測序數(shù)據(jù)集中難以直接識別miRNA靶基因，以及難以確定miRNA效應(yīng)，本文主要闡述miRNAs參與EMT過程中如何在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)揮作用，而運用了一種生物信息技術(shù)-EISA（exon-intron split analysis）。（Nucleic Acids Research，IF=11.147 ，Extensive transcriptional responses are co-ordinated by microRNAs as revealed by Exon-Intron Split Analysis (EISA)）
研究背景：miR-200c是一個促間質(zhì)轉(zhuǎn)化上皮的 microRNA。
一、EISA成功區(qū)分轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控

      我們初步比較人乳腺上皮細胞(HMLEs)的內(nèi)含子豐度的變化與活性和非活性基因的標志的一致性。
圖A：一種通過TGF進入間充質(zhì)狀態(tài)EMT細胞模型(MesHMLE)， miR-200C驅(qū)動間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化后，前5%的轉(zhuǎn)錄上調(diào)和下調(diào)基因 (ΔI)，由ChIP-Seq獲得活性染色質(zhì)(H3K4me3，H3K9-14ac，H3K27c-綠色)和非活性染色質(zhì)(H3K27me3-紅色)的標記物的相對富集。在一個跨越25個基因滑動窗口中紅色/綠色陰影顯示了測量的均值。(每第5個窗口繪圖)。
圖B：由EISA分析所有組蛋白標記與轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達相關(guān)(大ΔI)。相反，活性基因和非活性基因的標記與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的基因(大ΔE-ΔI，小ΔI，圖1B)的相關(guān)性小.因此，EISA度量ΔI表明了基因轉(zhuǎn)錄的影響?；趫DA的ΔE-ΔI的評分。
圖C：對轉(zhuǎn)染miR-200C的mesHMLE細胞的RNA-seq數(shù)據(jù)進行EISA分析，以評價miR-200C相對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后效應(yīng)?；讦:ΔI， 轉(zhuǎn)錄后miR-200 C靶點的測量值負值。
圖D：由ΔE-ΔI、ΔI、ΔE確定基因表達的累積分布（fold change），來預(yù)測響應(yīng)miR-200C的靶位點。
二、miR-200c轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)EGF信號網(wǎng)絡(luò)

      鑒于EISA能有效區(qū)分轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，我們關(guān)注在轉(zhuǎn)錄后下調(diào)基因。對miR-200C和預(yù)測的靶點進行分析，以及確定在HMLE系統(tǒng)中由miR-200C直接調(diào)控的基因和通路。
圖A：通過TargetScan或MicroT-CDS預(yù)測miR-200c的靶基因，（ΔE-ΔI，前1000位轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控基因）。通過基因本體論研究靶基因之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在EMT中EGFR信號通路的foid enrichment是最高的。 
圖B：轉(zhuǎn)錄后下調(diào)基因的大多數(shù)是預(yù)測的高重疊和預(yù)測目標的靶基因。通過the targetscan and microT-CDS algorithms預(yù)測，miR200c和miR200c目標反應(yīng)的1000、500和200個轉(zhuǎn)錄后下調(diào)的基因。
圖C：在EGF信號網(wǎng)絡(luò)3’ UTR 熒光素酶報告基因測定miR-200c靶標。
圖D：在EGFR下游的信號網(wǎng)絡(luò)中miR-200C的靶基因(藍色陰影)。KEGG pathway顯示Akt和ERK被激活。
圖E：用EGF處理Meshmle細胞，Western Blot檢測在miR-200c表達或不表達的情況下的EGFR、Akt、MEK和ERK(或總蛋白)的磷酸化。
三、在EMT/MET過程中Mir-200 c和TGFβ共同調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

圖A：ΔE-ΔI (轉(zhuǎn)錄后),ΔI (轉(zhuǎn)錄)表示EISA定義的基因調(diào)控效應(yīng). 雖然miRNAs的直接作用是轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的，例如miR-200 c對EGF信號的抑制，圖中分別顯示miR-200 c與TGFβ在EMT/MET過程中發(fā)生的基因表達變化，其發(fā)生ΔE-ΔI (轉(zhuǎn)錄后)與ΔI (轉(zhuǎn)錄)。
圖B：雖然已經(jīng)確定miRNAs和轉(zhuǎn)錄因子(TGFβ)之間的相互作用，但miRNA研究的一個主要焦點是通過直接作用于靶標來理解其功能。然而，EISA表明，許多對miR-200C的反應(yīng)是間接的(ΔI)。為了探討這些轉(zhuǎn)錄變化的意義，基因本體論(分子功能)分析了在MEHMLE細胞對miR-200反應(yīng)和在HMGLE細胞中對TGF反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)和下調(diào)基因集。
圖C：在轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因中，例如ZEB 1等，間質(zhì)促進轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點富集在ENCODE ChIP- Seq數(shù)據(jù)集。每個條形表示單個ChIP- Seq數(shù)據(jù)集。
圖D：相對于miR-200c(ΔE-ΔI)轉(zhuǎn)錄后下調(diào)的相對程度，顯示了TFs介導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄變化。轉(zhuǎn)錄后被miR-200 c下調(diào)且在它們的3’端內(nèi)具有miR-200 c結(jié)合位點的TFs。
圖E：TF靶基因是從 ChIP- Seq數(shù)據(jù)中獲取的，然然后與根據(jù)miR-200轉(zhuǎn)錄上調(diào)或下調(diào)的基因交叉引用。
四、功能顯著的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是miRNAs的一個廣泛特征。

圖A-B：為了研究miRNA干擾中是否與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)有關(guān)，我們對EISA進行了多個數(shù)據(jù)集的分析，發(fā)現(xiàn)在所檢測的8個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，27%到73%的基因是共同的。表達ZEB 1或多個miRNAs的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機制的相對貢獻用散點圖(B)( ΔE-ΔI：ΔI)
圖C：無論這是轉(zhuǎn)錄上調(diào)基因還是下調(diào)基因，為每個選定的miRNA進行10個基因 fold enrichment。