Gal-1—惡性外周神經鞘瘤治療的靶點

MPNST是一種預后較差的惡性腫瘤（5年生存率<50%），是1型神經纖維瘤病患者死亡增加的主要原因。手術切除神經纖維瘤是MPNST的主要治療方法。對于無法切除或轉移的疾病，化療藥物的療效甚微。然而，目前還沒有有效的系統(tǒng)治療MPNST患者的方法。Ras信號通路在MPNST患者中普遍失調。眾所周知， Gal-1是穩(wěn)定膜Ras的關鍵，從而誘導Ras的活化。然而，Gal-1在MPNST進展中的作用尚不清楚。

今天小編帶大家了解近期發(fā)表的關于Gal-1抑制誘導MPNST細胞凋亡的文章Galectin-1 inhibition induces cell apoptosis through dual suppression of CXCR4 and Ras pathways in human malignant peripheral nerve sheath tumors。
本研究采用細胞存活率、凋亡測定和菌落形成等方法，觀察抑制Gal-1在MPNST細胞中的作用，以及使用人類MPNST異種移植模型來評估Gal-1抑制劑LLS2的生長和轉移抑制作用。發(fā)現(xiàn)Gal-1的上調在MPNST的CXCR4和RAS/ERK通路中起著至關重要的作用。siRNA敲除Gal-1或LLS2處理能有效誘導MPNST細胞凋亡，抑制MPNST細胞系的生長。鑒于這些結果，我們認為Gal-1是治療MPNST的良好靶點，LLS2是開發(fā)新的MPNST治療方法的良好先導化合物。
結果：
1）Gal-1在MPNST中的表達
鑒于Ras是一種眾所周知的致癌因子，且Ras活性受Gal-1調控，我們預測Gal-1是MPNST的治療靶點。我們首先從Henderson和Nakayama的Oncomine數(shù)據集中檢測了人類NF1的LGALS1轉錄水平，發(fā)現(xiàn)LGALS1在神經纖維瘤和MPNST中顯著升高（圖1A）。我們已經知道，NF1的缺失與NF1患者RAS/MAPK信號的激活有關。有報道稱，在NF1患者中，CXCR4過表達。正如所料，在這兩個數(shù)據集中，在NF1患者上，NF1表達下調，CXCR4表達上調。此外，還檢測了人正常神經組織、神經纖維瘤和MPNST中Gal-1蛋白的表達水平。MPNST組Gal-1表達水平明顯高于正常神經組織和神經纖維瘤（圖1B）。

2）MPNST細胞中Gal-1消耗的影響
選擇內源性Gal-1表達的NF96.2（NF1-/-）和NF02.2（NF1+/+）MPNST細胞系，進一步闡明Gal-1在MPNST中的功能（圖2A，B）。用siRNA轉染NF96.2和NF2.2 MPNST細胞，轉染Gal-1后，如預期一樣，western blot檢測發(fā)現(xiàn)Gal-1表達降低（圖2B）。此外，敲除Gal-1能夠抑制細胞生長（圖2C），誘導凋亡膜泡化（圖2D）和半胱天冬酶活性（圖2E）。這些結果表明，Gal-1的下調可降低MPNST細胞的活力，誘導細胞凋亡。

3）Gal-1基因敲除在體內表現(xiàn)出抗腫瘤活性

接下來我們評估了Gal-1基因下調對MPNST腫瘤生長的影響。在體內試驗之前，我們進行了菌落形成試驗。這種不依賴錨定的生長試驗被認為是體內活性的一個很好的預測因子。轉染靶向Gal-1的shRNA質粒后，Gal-1表達穩(wěn)定。使用shGal-1質粒敲除Gal-1也會損害NF1 / NF96.2細胞生長（圖3A）。NF96.2細胞在2周后形成菌落（圖3B）。NF96.2細胞中Gal-1表達下調對菌落形成有明顯的抑制作用。為了研究Gal-1介導的體內致瘤性，我們將表達對照shRNA或shGal-1的NF96.2熒光素酶標記細胞皮下注射到裸鼠體內。體內致瘤研究表明，Gal-1敲除顯著抑制裸鼠腫瘤生長（圖3C，D）。實驗結束時，切除異種移植體并稱重，以確認體內生物熒光成像結果（圖3E）。這一發(fā)現(xiàn)表明Gal-1在MPNST的發(fā)生發(fā)展中具有致癌作用。
4）Ras信號被Gal-1的下調所抑制

RAS通路在MPNST中經常被激活?？紤]到Gal-1對穩(wěn)定膜Ras至關重要，從而誘導Ras的活化，我們研究了Gal-1的下調是否會影響Ras信號通路。我們使用了一個Ras下拉激活實驗來測定活化的Ras水平。我們還評估了CXCR4、磷酸化MEK和磷酸化ERK的表達水平，這些都是癌癥的重要治療靶點。shRNA敲除Gal-1可顯著降低活性Ras基因、CXCR4的表達以及MEK和ERK磷酸化的減少（圖4B-4D）。進一步證實Gal-1下調是否通過下調Ras和CXCR4抑制MPNST細胞增殖，誘導細胞凋亡，將pcDNA-H-Ras（G12V）或pcDNA-CXCR4載體與shGal-1質粒共轉染至NF96.2或NF2.2細胞（圖4B，4C）?；謴虷-Ras（G12V）或CXCR4可抑制Gal-1 shRNA轉染細胞的凋亡和細胞死亡（圖4E，4F）。總之，這些數(shù)據強烈表明，Gal-1的下調導致CXCR4和Ras/ERK通路的抑制，從而抑制癌細胞的增殖。
5）LLS2對MPNST細胞中Gal-1的藥理抑制作用
Gal-1特異性siRNA對MPNST細胞生長抑制作用強，提示Gal-1是治療NF1的理想靶點。LLS2是一種新型的小分子Gal-1抑制劑，通過篩選單粒雙化合物組合文庫鑒定。在實驗中，測試了LLS2是否對MPNST細胞有類似的抗腫瘤作用。發(fā)現(xiàn)LLS2確實對NF96.2和NF2.2細胞具有毒性（圖5A）。此外，還發(fā)現(xiàn)LLS2能夠誘導這些MPNST細胞的凋亡并抑制菌落形成（圖5B，5C）。用25μM LLS2處理24h后，Ras活性、CXCR4、MEK磷酸化和ERK磷酸化減少（圖5D，5E）。

6）LLS2在NF1-/- NF96.2異種移植模型中具有抗腫瘤活性
為了進一步評估了LLS2對MPNST腫瘤生長的影響。我們通過皮下注射將NF96.2細胞植入裸鼠體內。實驗結束時切除腫瘤并稱重。發(fā)現(xiàn)LLS2顯著降低了NF96.2腫瘤的生長（圖6A-6C）。接下來，為了考慮MPNST的侵襲性，我們建立了肺轉移模型來評估LLS2的轉移抑制作用。研究表明，12周時，LLS2處理小鼠未發(fā)現(xiàn)腫瘤的跡象，而在對照組小鼠中觀察到明顯的腫瘤負荷（圖6D）。這些研究證明了LLS2在體內抑制原發(fā)腫瘤生長和轉移的治療效果。