Gal-1—惡性外周神經(jīng)鞘瘤治療的靶點

MPNST是一種預(yù)后較差的惡性腫瘤（5年生存率<50%），是1型神經(jīng)纖維瘤病患者死亡增加的主要原因。手術(shù)切除神經(jīng)纖維瘤是MPNST的主要治療方法。對于無法切除或轉(zhuǎn)移的疾病，化療藥物的療效甚微。然而，目前還沒有有效的系統(tǒng)治療MPNST患者的方法。Ras信號通路在MPNST患者中普遍失調(diào)。眾所周知， Gal-1是穩(wěn)定膜Ras的關(guān)鍵，從而誘導(dǎo)Ras的活化。然而，Gal-1在MPNST進展中的作用尚不清楚。

今天小編帶大家了解近期發(fā)表的關(guān)于Gal-1抑制誘導(dǎo)MPNST細(xì)胞凋亡的文章Galectin-1 inhibition induces cell apoptosis through dual suppression of CXCR4 and Ras pathways in human malignant peripheral nerve sheath tumors。
本研究采用細(xì)胞存活率、凋亡測定和菌落形成等方法，觀察抑制Gal-1在MPNST細(xì)胞中的作用，以及使用人類MPNST異種移植模型來評估Gal-1抑制劑LLS2的生長和轉(zhuǎn)移抑制作用。發(fā)現(xiàn)Gal-1的上調(diào)在MPNST的CXCR4和RAS/ERK通路中起著至關(guān)重要的作用。siRNA敲除Gal-1或LLS2處理能有效誘導(dǎo)MPNST細(xì)胞凋亡，抑制MPNST細(xì)胞系的生長。鑒于這些結(jié)果，我們認(rèn)為Gal-1是治療MPNST的良好靶點，LLS2是開發(fā)新的MPNST治療方法的良好先導(dǎo)化合物。
結(jié)果：
1）Gal-1在MPNST中的表達(dá)
鑒于Ras是一種眾所周知的致癌因子，且Ras活性受Gal-1調(diào)控，我們預(yù)測Gal-1是MPNST的治療靶點。我們首先從Henderson和Nakayama的Oncomine數(shù)據(jù)集中檢測了人類NF1的LGALS1轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)LGALS1在神經(jīng)纖維瘤和MPNST中顯著升高（圖1A）。我們已經(jīng)知道，NF1的缺失與NF1患者RAS/MAPK信號的激活有關(guān)。有報道稱，在NF1患者中，CXCR4過表達(dá)。正如所料，在這兩個數(shù)據(jù)集中，在NF1患者上，NF1表達(dá)下調(diào)，CXCR4表達(dá)上調(diào)。此外，還檢測了人正常神經(jīng)組織、神經(jīng)纖維瘤和MPNST中Gal-1蛋白的表達(dá)水平。MPNST組Gal-1表達(dá)水平明顯高于正常神經(jīng)組織和神經(jīng)纖維瘤（圖1B）。

2）MPNST細(xì)胞中Gal-1消耗的影響
選擇內(nèi)源性Gal-1表達(dá)的NF96.2（NF1-/-）和NF02.2（NF1+/+）MPNST細(xì)胞系，進一步闡明Gal-1在MPNST中的功能（圖2A，B）。用siRNA轉(zhuǎn)染NF96.2和NF2.2 MPNST細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Gal-1后，如預(yù)期一樣，western blot檢測發(fā)現(xiàn)Gal-1表達(dá)降低（圖2B）。此外，敲除Gal-1能夠抑制細(xì)胞生長（圖2C），誘導(dǎo)凋亡膜泡化（圖2D）和半胱天冬酶活性（圖2E）。這些結(jié)果表明，Gal-1的下調(diào)可降低MPNST細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3）Gal-1基因敲除在體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤活性

接下來我們評估了Gal-1基因下調(diào)對MPNST腫瘤生長的影響。在體內(nèi)試驗之前，我們進行了菌落形成試驗。這種不依賴錨定的生長試驗被認(rèn)為是體內(nèi)活性的一個很好的預(yù)測因子。轉(zhuǎn)染靶向Gal-1的shRNA質(zhì)粒后，Gal-1表達(dá)穩(wěn)定。使用shGal-1質(zhì)粒敲除Gal-1也會損害NF1 / NF96.2細(xì)胞生長（圖3A）。NF96.2細(xì)胞在2周后形成菌落（圖3B）。NF96.2細(xì)胞中Gal-1表達(dá)下調(diào)對菌落形成有明顯的抑制作用。為了研究Gal-1介導(dǎo)的體內(nèi)致瘤性，我們將表達(dá)對照shRNA或shGal-1的NF96.2熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。體內(nèi)致瘤研究表明，Gal-1敲除顯著抑制裸鼠腫瘤生長（圖3C，D）。實驗結(jié)束時，切除異種移植體并稱重，以確認(rèn)體內(nèi)生物熒光成像結(jié)果（圖3E）。這一發(fā)現(xiàn)表明Gal-1在MPNST的發(fā)生發(fā)展中具有致癌作用。
4）Ras信號被Gal-1的下調(diào)所抑制

RAS通路在MPNST中經(jīng)常被激活。考慮到Gal-1對穩(wěn)定膜Ras至關(guān)重要，從而誘導(dǎo)Ras的活化，我們研究了Gal-1的下調(diào)是否會影響Ras信號通路。我們使用了一個Ras下拉激活實驗來測定活化的Ras水平。我們還評估了CXCR4、磷酸化MEK和磷酸化ERK的表達(dá)水平，這些都是癌癥的重要治療靶點。shRNA敲除Gal-1可顯著降低活性Ras基因、CXCR4的表達(dá)以及MEK和ERK磷酸化的減少（圖4B-4D）。進一步證實Gal-1下調(diào)是否通過下調(diào)Ras和CXCR4抑制MPNST細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將pcDNA-H-Ras（G12V）或pcDNA-CXCR4載體與shGal-1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至NF96.2或NF2.2細(xì)胞（圖4B，4C）?；謴?fù)H-Ras（G12V）或CXCR4可抑制Gal-1 shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞死亡（圖4E，4F）?？傊?，這些數(shù)據(jù)強烈表明，Gal-1的下調(diào)導(dǎo)致CXCR4和Ras/ERK通路的抑制，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。
5）LLS2對MPNST細(xì)胞中Gal-1的藥理抑制作用
Gal-1特異性siRNA對MPNST細(xì)胞生長抑制作用強，提示Gal-1是治療NF1的理想靶點。LLS2是一種新型的小分子Gal-1抑制劑，通過篩選單粒雙化合物組合文庫鑒定。在實驗中，測試了LLS2是否對MPNST細(xì)胞有類似的抗腫瘤作用。發(fā)現(xiàn)LLS2確實對NF96.2和NF2.2細(xì)胞具有毒性（圖5A）。此外，還發(fā)現(xiàn)LLS2能夠誘導(dǎo)這些MPNST細(xì)胞的凋亡并抑制菌落形成（圖5B，5C）。用25μM LLS2處理24h后，Ras活性、CXCR4、MEK磷酸化和ERK磷酸化減少（圖5D，5E）。

6）LLS2在NF1-/- NF96.2異種移植模型中具有抗腫瘤活性
為了進一步評估了LLS2對MPNST腫瘤生長的影響。我們通過皮下注射將NF96.2細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)。實驗結(jié)束時切除腫瘤并稱重。發(fā)現(xiàn)LLS2顯著降低了NF96.2腫瘤的生長（圖6A-6C）。接下來，為了考慮MPNST的侵襲性，我們建立了肺轉(zhuǎn)移模型來評估LLS2的轉(zhuǎn)移抑制作用。研究表明，12周時，LLS2處理小鼠未發(fā)現(xiàn)腫瘤的跡象，而在對照組小鼠中觀察到明顯的腫瘤負(fù)荷（圖6D）。這些研究證明了LLS2在體內(nèi)抑制原發(fā)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的治療效果。