自然殺傷細(xì)胞對(duì)肺腺癌適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用

近日，麻省理工學(xué)院在PNAS上發(fā)表了一篇題名為：通過自然殺傷細(xì)胞刺激增強(qiáng)肺腺癌的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的文章。該研究設(shè)計(jì)了一種用于在腫瘤中誘導(dǎo)表達(dá)活化配體的系統(tǒng)。刺激后，自然殺傷（NK）細(xì)胞定位于腫瘤內(nèi)部，細(xì)胞因子產(chǎn)生能力增強(qiáng)。T細(xì)胞也以NK細(xì)胞依賴性方式聚集到腫瘤中，并表現(xiàn)出更高的功能性。在表達(dá)新抗原的腫瘤中，NK細(xì)胞刺激增強(qiáng)了腫瘤特異性T細(xì)胞的數(shù)量和功能，并且在長(zhǎng)期環(huán)境中減少了腫瘤生長(zhǎng)。NK細(xì)胞也可以被激活以促進(jìn)抗腫瘤免疫，從而支持它們作為癌癥免疫療法中的重要靶標(biāo)的潛力。

1.NK細(xì)胞在LUAD小鼠模型中表現(xiàn)為不成熟表型和低功能性
為了研究NK細(xì)胞和肺腫瘤之間的相互作用，使用了由Cre重組酶誘導(dǎo)的致癌Kras G12D激活和腫瘤抑制因子p53 缺失驅(qū)動(dòng)的LUAD 小鼠模型。用Lenti-Cre氣管內(nèi)感染KP小鼠，引發(fā)腫瘤形成。通過流式細(xì)胞術(shù)，觀察到與健康肺相比，在攜帶腫瘤的肺中具有NK細(xì)胞特征性標(biāo)志物（NK1.1 +; CD8-; CD4-或NK1.1 +; CD3-）的細(xì)胞數(shù)量增加，而健康肺組織隔室中很少有NK樣細(xì)胞。這些標(biāo)記物不能區(qū)分cNK細(xì)胞和ILC1亞型;進(jìn)一步的免疫表型分析顯示，根據(jù)DX5（CD49b）染色，該群體可細(xì)分為2組，并且這些DX5 +和DX5-亞群可在健康和攜帶腫瘤的肺組織中發(fā)現(xiàn)。還觀察到Ly49H NK細(xì)胞激活受體的表達(dá)局限于G1-ILC中的DX5 +組，表明這是在肺中cNK細(xì)胞上特異性表達(dá)的標(biāo)志物。使用抗Nkp46抗體對(duì)腫瘤切片進(jìn)行IHC染色顯示G1-ILC位于腫瘤周圍的基質(zhì)中，而不是腫瘤內(nèi)。流式細(xì)胞儀分析顯示，與血液和脾臟來源的細(xì)胞相比，肺組織中具有更多未成熟cNK細(xì)胞的表面標(biāo)志物表型（CD11blow; CD27high; KLRG1low）特征。與血液來源的細(xì)胞相比，組織G1-ILC顯示出低的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力。由于從攜帶腫瘤的肺中分離出有限的細(xì)胞，無法進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。然而，觀察到組織來源的G1-ILC上的CD107a表達(dá)水平高于血液來源的細(xì)胞。盡管仍有待確定該表型是否與該群體中的細(xì)胞毒性功能相關(guān)。有趣的是，在健康和攜帶腫瘤的肺部分離的細(xì)胞之間看到了相似的表面表型和功能能力，這表明這些是肺組織隔室中NK樣細(xì)胞與血液相比具有一般特征?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，盡管它們富集KP肺腫瘤，G1-ILC表現(xiàn)出低功能性，類似于人LUAD中的NK細(xì)胞，提出了NK細(xì)胞功能是否可以在確定疾病的情況下用于治療干預(yù)。

2.NK細(xì)胞應(yīng)答可以在既定腫瘤中增強(qiáng)。
在肺上皮特異性細(xì)胞分泌蛋白（Ccsp）啟動(dòng)子（KP rtTA）的控制下，進(jìn)入KP模型，進(jìn)入反向四環(huán)素反式激活因子（rtTA）轉(zhuǎn)基因，從而可以在肺腫瘤中特異性誘導(dǎo)NK細(xì)胞配體的表達(dá)。為了研究是否可以在確定的KP肺癌中刺激NK細(xì)胞反應(yīng)，使用Lenti-TREm157（或Lenti-TREnegm157）啟動(dòng)腫瘤，允許它們生長(zhǎng)10至14周，然后將小鼠置于含有Dox的飲食中誘導(dǎo)M157表達(dá)。配體誘導(dǎo)一周后，與對(duì)照組相比，觀察到腫瘤攜帶肺組織中總G1-ILC數(shù)量增加和m157特異性（Ly49H +）NK細(xì)胞富集。Ly49H + NK細(xì)胞在配體后第2天表現(xiàn)出增增加。有趣的是，在相同的動(dòng)物中觀察到Ly49H-G1-ILC的后來（第6天）Ly49H非依賴性增殖期，可能是由于Ly49H + NK細(xì)胞刺激產(chǎn)生的促炎信號(hào)。觀察到m157誘導(dǎo)后Ly49H + NK細(xì)胞上Ly49H的表面水平降低，這是通過該途徑發(fā)出信號(hào)的特征。在離體刺激測(cè)定中，與對(duì)照相組比，G1-ILC在腫瘤中m157誘導(dǎo)后表現(xiàn)出更高的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力。m157誘導(dǎo)也導(dǎo)致NKp46 +細(xì)胞的瘤內(nèi)定位增加，相比之下，這些細(xì)胞在對(duì)照腫瘤中更嚴(yán)格的基質(zhì)存在。這些發(fā)現(xiàn)表明NK細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力可以通過cNK細(xì)胞特異性識(shí)別的活化進(jìn)行增強(qiáng)。

3.刺激的NK細(xì)胞將適應(yīng)性免疫細(xì)胞募集到腫瘤中。
接下來，想探討NK細(xì)胞刺激對(duì)該模型中適應(yīng)性免疫的影響。使用流式細(xì)胞術(shù)，組織學(xué)和IHC組合分析，觀察到T細(xì)胞和B細(xì)胞強(qiáng)烈募集到誘導(dǎo)表達(dá)m157的腫瘤。攜帶腫瘤的肺組織中T和B淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加依賴于NK1.1 +細(xì)胞，這種效應(yīng)因其消耗而被消除，表明T細(xì)胞和B細(xì)胞的募集不僅僅是由于針對(duì)自身的適應(yīng)性反應(yīng)。此外， negm157突變體的表達(dá)，與m157僅相差3個(gè)氨基酸，不會(huì)導(dǎo)致T或B細(xì)胞的募集。與對(duì)照相比，來自表達(dá)m157的腫瘤的肺組織T細(xì)胞響應(yīng)于離體刺激表現(xiàn)出更高的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力。雖然CD44 +和CD44-T細(xì)胞都被募集到腫瘤中，但m157誘導(dǎo)促進(jìn)了抗原，CD44 + CD4 +和CD8 + T細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果表明在已建立的肺腫瘤中刺激NK細(xì)胞應(yīng)答導(dǎo)致適應(yīng)性免疫細(xì)胞的募集和增強(qiáng)的T細(xì)胞功能。

4.CCL5（RANTES）在淋巴細(xì)胞向腫瘤的募集中發(fā)揮作用
為了研究在系統(tǒng)中向T細(xì)胞募集T細(xì)胞所涉及的因素，從來自KP rtTA或KP rtTA; Ly49H缺陷的腫瘤肺中制備裂解物。小鼠在配體后第0,2和6天誘導(dǎo)并使用細(xì)胞因子和趨化因子陣列分析它們。盡管不能排除IFN-γ在m157誘導(dǎo)的反應(yīng)中的作用，但陣列分析并未發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞因子的顯著富集。確實(shí)發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL5和細(xì)胞因子IL-12顯著增加。通過流式細(xì)胞術(shù)分析觀察到m157誘導(dǎo)后CCL5 + G1-ILC的比例增加，表明NK細(xì)胞可能是這種情況下CCL5的來源。為了直接測(cè)試CCL5的作用，使用中和抗體在m157誘導(dǎo)前阻斷其功能。 CCL5阻斷消除了CD8 + T細(xì)胞向腫瘤的募集。還觀察到腫瘤中G1-ILC和CD4 + T細(xì)胞數(shù)量減少的趨勢(shì)，盡管這沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。來自配體表達(dá)腫瘤的T細(xì)胞在離體刺激測(cè)定中顯示出CCL5阻斷的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力降低，但重要的是，沒有區(qū)分CCL5是否直接影響T細(xì)胞應(yīng)答或僅僅是招募功能不同的T細(xì)胞亞群，或兩者兼而有之。G1-ILC的細(xì)胞因子產(chǎn)生沒有顯著影響，表明它們的功能不依賴于CCL5。這些結(jié)果表明CCL5在NK細(xì)胞依賴性募集CD8 + T細(xì)胞至腫瘤中起作用。

5.刺激的NK細(xì)胞反應(yīng)是短暫的，可以通過IL-15加強(qiáng)
為了研究NK細(xì)胞刺激對(duì)抗腫瘤反應(yīng)的長(zhǎng)期影響，檢查了淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能。3周后，G1-ILC的數(shù)量和細(xì)胞因子產(chǎn)生能力不再比對(duì)照增加。這些結(jié)果表明，盡管NK細(xì)胞仍然對(duì)已建立的腫瘤中的刺激具有反應(yīng)性，但它們的反應(yīng)是短暫的，可能是由于TME中存在免疫抑制因子或僅僅是誘導(dǎo)NK細(xì)胞低反應(yīng)性的內(nèi)在負(fù)反饋機(jī)制。在配體誘導(dǎo)3周后，T細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞因子產(chǎn)生能力也不再高于對(duì)照組。
在治療環(huán)境中，NK細(xì)胞反應(yīng)的短暫性質(zhì)可能對(duì)組合治療的合理時(shí)機(jī)具有重要意義。例如，可能存在有限的時(shí)間窗口，在此期間NK細(xì)胞靶向治療可以增強(qiáng)由T細(xì)胞靶向療法實(shí)現(xiàn)的抗腫瘤免疫。值得注意的是，觀察到氣管內(nèi)給予IL-15（一種已知可刺激NK細(xì)胞活化的細(xì)胞因子）均可增強(qiáng)G1-ILC反應(yīng)，類似于對(duì)照腫瘤中的配體誘導(dǎo)，并在長(zhǎng)期配體表達(dá)后挽救了G1-ILC反應(yīng)下降，細(xì)胞數(shù)，術(shù)語Ly49H + G1-ILC和CCL5染色，以及細(xì)胞因子產(chǎn)生，表明用于啟動(dòng)或延長(zhǎng)NK細(xì)胞應(yīng)答窗口的治療途徑。重要的是，雖然IL-15給藥在持續(xù)m157刺激后增加了Ly49H +細(xì)胞的比例，但它可能作用于所有G1-ILC群體，以及T細(xì)胞和其他亞群，與先前的刺激無關(guān)。因此，無法區(qū)分IL-15是否起作用以拯救先前刺激的NK細(xì)胞，或者可能將循環(huán)NK細(xì)胞募集到攜帶腫瘤的肺組織中，或兩者兼而有之。
值得注意的是，實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明，KP模型中的腫瘤很少獲得非同義編碼突變，這表明KP腫瘤基本上沒有新抗原。因此，在缺乏強(qiáng)抗原的情況下，適應(yīng)性免疫應(yīng)答可能無法獲得牽引力，導(dǎo)致其在NK細(xì)胞功能喪失后下降。重要的是，沒有描述在這種“非免疫原性”系統(tǒng)中招募腫瘤的T細(xì)胞的特異性，無法確定它們是否識(shí)別腫瘤抗原，或者是否他們的招募是抗原非依賴性的。

6.NK細(xì)胞刺激導(dǎo)致增強(qiáng)的腫瘤特異性T細(xì)胞應(yīng)答
利用LucOS / TREm157系統(tǒng)產(chǎn)生免疫原性腫瘤，然后在攜帶腫瘤的小鼠中14至16周后施用Dox以刺激NK細(xì)胞，并且在1周后收獲組織用于分析。實(shí)驗(yàn)室LucOS系統(tǒng)的先前工作表明，在腫瘤開始后14至16周，抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量和功能已經(jīng)下降，并獲得了疲憊的表型。正如之前在非免疫原性KP肺腫瘤中所見，m157配體誘導(dǎo)也導(dǎo)致在該環(huán)境中腫瘤組織中整體CD8 + T細(xì)胞數(shù)量增加。使用SIIN-四聚體，觀察到表達(dá)配體的腫瘤也富含抗原特異性T細(xì)胞。最后，測(cè)試了NK細(xì)胞刺激是否可以增強(qiáng)過繼轉(zhuǎn)移的抗原特異性T細(xì)胞的反應(yīng)。從OTI TCR-轉(zhuǎn)基因小鼠的脾中分離出一千萬個(gè)先天性標(biāo)記的（Thy1.1 +）幼稚SIIN特異性T細(xì)胞，并在Dox施用后1天將眼窩后轉(zhuǎn)移到具有LucOS / TREm157腫瘤的動(dòng)物中。十天后，觀察到轉(zhuǎn)移的OTI T細(xì)胞在NK細(xì)胞刺激后構(gòu)成比對(duì)照動(dòng)物更大的CD8 + T細(xì)胞群。此外，觀察到離體刺激測(cè)定中轉(zhuǎn)移的來自NK細(xì)胞配體誘導(dǎo)的腫瘤的OTI細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，免疫原性腫瘤中的NK細(xì)胞刺激可以通過募集（在內(nèi)源性T細(xì)胞的情況下）或通過募集和增強(qiáng)功能（在過繼性T細(xì)胞治療的情況下）改善腫瘤特異性T細(xì)胞應(yīng)答，因此增強(qiáng)抗腫瘤免疫力。因此，用于刺激TME中的NK細(xì)胞的治療方法可以與基于T細(xì)胞的癌癥治療互補(bǔ)。

7.NK細(xì)胞可以增強(qiáng)免疫原性腫瘤的控制
為了評(píng)估NK細(xì)胞是否可以在長(zhǎng)期環(huán)境中存在刺激信號(hào)的情況下影響肺癌進(jìn)展，開始使用Dox飲食小鼠，然后在1天后使用Lenti-TREm157或Lenti-TREnegm157啟動(dòng)腫瘤，并繼續(xù)使用Dox在腫瘤發(fā)展過程中進(jìn)行治療直至小鼠瀕臨死亡。觀察到在攜帶腫瘤的小鼠中總體存活率僅有適度增加，所述腫瘤在腫瘤發(fā)展早期表達(dá)激活的NK細(xì)胞配體，表明單獨(dú)的NK細(xì)胞不能提供針對(duì)疾病進(jìn)展的實(shí)質(zhì)性保護(hù)，即使腫瘤被迫表達(dá)刺激信號(hào)。
為了評(píng)估NK細(xì)胞刺激對(duì)該模型中免疫原性腫瘤進(jìn)展的影響，開始表達(dá)具有或不具有誘導(dǎo)型m157的LucOS的腫瘤，并且在1周后施用Dox。將小鼠保持在Dox上12周，之后收集組織用于分析。引人注目的是，與攜帶OVA腫瘤的肺相比，觀察到LucOS / TREm157荷瘤肺中的腫瘤負(fù)荷顯著降低。LucOS / TREm157腫瘤的數(shù)量較少且尺寸小于LucOS腫瘤，表明免疫原性腫瘤中的NK細(xì)胞刺激導(dǎo)致消除病變并抑制確實(shí)出現(xiàn)的腫瘤生長(zhǎng)?？傊?，這些實(shí)驗(yàn)表明，無論NK細(xì)胞是否在該模型中自然地形成腫瘤進(jìn)展，它們都能夠在刺激信號(hào)的存在下增強(qiáng)適應(yīng)性抗腫瘤免疫力。

結(jié)論:
作者認(rèn)為，導(dǎo)致腫瘤中NK細(xì)胞功能增強(qiáng)的策略可能是T細(xì)胞募集的強(qiáng)大機(jī)制，除了NK細(xì)胞直接殺傷的潛在有益作用外，還可以提高T細(xì)胞治療癌癥的療效。