揭秘一種新的circRNA，通過海綿miRNA調(diào)節(jié)mRNA的表達進而影響膀胱癌的進展

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是世界上最流行的惡性腫瘤之一。在中國，膀胱癌的死亡率和發(fā)病率在所有泌尿系統(tǒng)腫瘤中排名為第一。根據(jù)腫瘤侵襲的深度，膀胱癌可分為兩類：非肌肉侵襲性腫瘤（70~80％）和肌層浸潤性腫瘤（20~30％）。對于肌層浸潤性膀胱癌患者，轉(zhuǎn)移的發(fā)生更為頻繁，預(yù)后較差。即使在接受手術(shù)和化療最佳治療的肌肉浸潤性膀胱癌患者中，由于遠處轉(zhuǎn)移，5年總生存率僅為60％。因此，闡明推動膀胱癌進展的分子機制具有重要的臨床意義，這將有助于開發(fā)更有效的抗癌療法。
circRNA是一類新的內(nèi)源性非編碼RNA分子，其基本特征為共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)，沒有5'帽和3'poly尾。與線性RNA不同，circRNA通常源自外顯子或內(nèi)含子的反向剪接事件。反向互補序列（包括反向重復(fù)Alu對和外顯子跳躍）有助于circRNA形成。circRNAs的顯著特征包括強穩(wěn)定性，高豐度，進化保守和組織特異性表達。盡管多年前報道circRNA，但這些分子首先被認為是剪接錯誤的產(chǎn)物。RNA測序數(shù)據(jù)的全基因組分析已經(jīng)鑒定出大量的circRNA，并證明它們在哺乳動物細胞中是內(nèi)源的，豐富的和保守的。近年來已經(jīng)鑒定出circRNA的多種特性，由于一些circRNA具有miRNA結(jié)合位點，其作為“miRNA海綿”的作用最常被討論。CircRNAs海綿miRNA來阻止其對靶基因的調(diào)節(jié)。然而， circRNA在膀胱癌中的作用很少被報道。膀胱癌中circRNA的生物學(xué)功能很大程度上未知，需要進一步研究。
6月份，Lu Q等人發(fā)表一篇“Circular RNA circSLC8A1 acts as a sponge of miR-130b/miR-494 in suppressing bladder cancer progression via regulating PTEN”的SCI文章，IF=10.679，這項研究鑒定了源自SLC8A1基因的circRNA，稱為circSLC8A1。circSLC8A1的表達在膀胱癌組織和細胞系中顯著下調(diào)，并且與膀胱癌的臨床分期和分級呈正相關(guān)。這篇文獻也提出了假設(shè)，即circSLC8A1可能通過海綿miR-130b和miR-494來影響PTEN的表達參與膀胱癌的進展。
技術(shù)路線:

一、circSLC8A1（hsa_circ_0000994）在膀胱癌中顯著下調(diào)

圖1A.circSLC8A1在膀胱癌組織和細胞系中顯著下調(diào)。示意圖顯示了形成circSLC8A1的SLC8A1外顯子1的環(huán)化。RT-PCR證實了circSLC8A1的存在，Sanger測序驗證其反向剪接位點。紅色箭頭表示circSLC8A1的特殊剪接位點。B和CqRT-PCR實驗證實了與其鄰近的正常組織相比，70對人膀胱癌組織中circSLC8A1表達水平降低。D.qRT-PCR檢測SV-HUC-1和膀胱癌細胞系中circSLC8A1的表達水平。E.RT-PCR在5637和T24細胞系中驗證circSLC8A1的表達情況。引物擴增cDNA中的circSLC8A1但不擴增基因組DNA（gDNA），GAPDH作為陰性對照。F.qRT-PCR檢測RNaseR處理或不處理后的5637和T24細胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達情況。將circSLC8A1和SLC8A1mRNA的相對水平標(biāo)準(zhǔn)化為模擬處理中測量的值。數(shù)據(jù)是平均值±SD，n=3。

二、過表達circSLC8A1抑制膀胱癌細胞遷移和侵襲

圖2 過表達circSLC8A1抑制膀胱癌細胞遷移和侵襲。A. 轉(zhuǎn)染circSLC8A1或?qū)φ召|(zhì)粒后，qRT-PCR檢測5637和T24細胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達水平。B. wound healing實驗檢測在5637和T24細胞中circSLC8A1對細胞遷移能力的影響。C和D. 轉(zhuǎn)染circSLC8A1或?qū)φ召|(zhì)粒后， transwell遷移和侵襲實驗檢測在5637和T24細胞中circSLC8A1對細胞遷移和侵襲能力。E. 5637和T24細胞轉(zhuǎn)染兩種sicircSLC8A1，qRT-PCR檢測每種sicircSLC8A1對circSLC8A1和SLC8A1mRNA的干擾效率。F. wound healing實驗檢測在5637和T24細胞中sicircSLC8A1-1對細胞遷移能力的影響。G和H transwell遷移和侵襲實驗檢測在5637和T24細胞中circSLC8A1敲減后對細胞遷移和侵襲能力的影響。數(shù)據(jù)是平均值±SD，n=3。
三、circSLC8A1 充當(dāng)膀胱癌細胞中 miR-130b 和 miR-494 的海綿

圖 3 circSLC8A1 充當(dāng)膀胱癌細胞中 miR-130b 和 miR-494 的海綿。A和B. 通過Pulldown下拉并用circSLC8A1 特異性探針富集5637， T24 和 SV-HUC-1 細胞裂解液中的 circSLC8A1，然后通過 qRT-PCR 檢測circSLC8A1 的表達水平， GAPDH 用作陰性對照。C,D 和 E.通過 circSLC8A1 下拉miRNA，并且通過circSLC8A1 探針在 5637 和 T24 細胞中下拉 miR-130b 和 miR-494。 qRT-PCR 檢測 5637， T24 和 SV-HUC-1細胞裂解液中 7 種 候選miRNA的相對水平。F 和 G 將生物素化的 miR-130b 或 miR-494 轉(zhuǎn)染到 5637 和 T24 細胞中，鏈霉抗生物素蛋白捕獲后，通過 qRT-PCR 定量 circSLC8A1 水平。H 和 I.免疫熒光實驗檢測在 T24細胞中的 circSLC8A1 和 miR-130b / miR-494 的 表達情況。細胞核染成藍色（DAPI）， circSLC8A1 染成紅色， miR-130b / miR-494 染成綠色。數(shù)據(jù)是平均值±SD，n = 3。
四、miR-130b和miR-494通過靶向PTEN促進膀胱癌進展

圖 4 miR-130b 和 miR-494 通過靶向 PTEN 促進膀胱癌進展。 A和B. qRT-PCR 結(jié)果顯示與正常的鄰近膀胱組織相比， 在膀胱癌組織（n = 30）中miR-130b 和 miR-494的表達上調(diào)。 C和D Pearson分析顯示 circSLC8A1 和 miR-130b / miR-494 的表達之間呈負相關(guān)。 E和 F CCK-8 結(jié)果實驗顯示 miR-130b 和 miR-494 促進 5637 和 T24 細胞的增殖。G 和 H Transwell 遷移和侵襲結(jié)果表明5637 和 T24 細胞中轉(zhuǎn)染 miR-130b 或 miR-494 mimics促進細胞遷移和侵襲。I和 J. 5637 和 T24 細胞中轉(zhuǎn)染 anti-miR-130b 或 anti-miR-494 抑制細胞遷移和侵襲。K.通過生物信息學(xué)分析預(yù)測 PTEN mRNA 的 3'-UTR 中的 miR-130b / miR-494 結(jié)合位點。 L.熒光素酶報告基因檢測 miR-130b / miR-494 和 PTEN mRNA 之間的相互作用。M. miR-130b 和 miR-494 分別下調(diào)了 PTEN 的蛋白質(zhì)表達水平。數(shù)據(jù)是平均值±SD，n = 3
五、circSLC8A1通過靶向miR-130b和miR-494調(diào)節(jié)PTEN表達并抑制膀胱癌進展

圖 5 circSLC8A1 通過靶向 miR-130b 和 miR-494 調(diào)節(jié) PTEN 表達并抑制膀胱癌進展。 A,B和 C. Transwell和 CCK-8 實驗證明circSLC8A1 抑制 5637 和 T24 細胞的侵襲能力和增殖，然而用 miR-130b 或 miR-494 共轉(zhuǎn)染細胞時，抑制作用被逆轉(zhuǎn)。D 和 E. 蛋白質(zhì)印跡顯示， miR-130b 和 miR-494 可以部分降低 PTEN 蛋白的表達水平，這是由 circSLC8A1 促進的。 F. 蛋白質(zhì)印跡分析 10 個配對的人膀胱癌標(biāo)本和正常相鄰組織樣本中的 PTEN 蛋白。數(shù)據(jù)是平均值±SD，n = 3。
六、circSLC8A1抑制體內(nèi)膀胱癌腫瘤的生長

圖 6 circSLC8A1 抑制體內(nèi)膀胱癌腫瘤的生長。A. circSLC8A1 或?qū)φ蛰d體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 T24 細胞的皮下注射到裸鼠中，建立皮下異種移植腫瘤（每組 n = 6）。 B. 裸鼠中異種移植物腫瘤形成的代表圖。 C. 和 D. 與對照載體組相比，circSLC8A1 處理的裸鼠腫瘤生長速度和體重明顯下降。E.通過 qRT-PCR 在腫瘤組織中檢測circSLC8A1， miR-130b 和 miR-494 的表達水平。F. 在異種移植物中使用 IHC 染色測量 PTEN， AKT，p-AKT 和 MMP9 的表達.