肝纖維化VS 自噬/外泌體

      肝纖維化是肝臟受到各種理化因素?fù)p傷，肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死，并且在壞死區(qū)內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的一種疾病，可發(fā)展為肝功能失常的肝硬化，甚至肝癌，有效干預(yù)肝纖維化的發(fā)生，能預(yù)防肝硬化和肝癌的發(fā)生，因此，肝纖維化是目前肝病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化被認(rèn)為是肝纖維化形成的重要環(huán)節(jié)，其合成和分泌的細(xì)胞外基質(zhì)在肝過(guò)度沉積可引起肝纖維化。今天小編就和大家分享一篇關(guān)于自噬和外泌體介導(dǎo)的HSC活化進(jìn)而影響肝纖維化進(jìn)程的文獻(xiàn)。

技術(shù)路線

1. TRIB3表達(dá)升高有助于肝纖維化的進(jìn)展
      纖維化肝中TRIB3,LC3-II:LC3-I, BECN1, PIK3C3,可溶性和不可溶性SQSTM1是升高的，看到TRIB3-SQSTM1和 SQSTM1-LC3相互作用，TRIB3的表達(dá)和SQSTM1或者LC3的表達(dá)是正相關(guān)，肝細(xì)胞和HSC細(xì)胞增加，TRIB3與SQSTM1共定位增加。

2.TRIB3敲除保護(hù)小鼠免受TAA誘導(dǎo)的肝纖維化
      TAA處理12周后，Trib3敲低小鼠顯示較少的結(jié)節(jié)、黃疸和肝臟浸潤(rùn)性炎癥細(xì)胞減少，肝臟的間質(zhì)非血管區(qū)膠原積聚減少，羥脯氨酸含量降低，Col1a1，Timp1和Tgfb1的mRNA水平降低。TAA處理的Trib3 [LKD]小鼠中ACTA2表達(dá)減弱。為檢測(cè)沉默TRIB3是否可以通過(guò)自噬影響肝纖維化，檢查自噬信號(hào)蛋白在纖維化肝組織中的表達(dá)。沉默Trib3抑制LC3-II：LC3-I，BECN1和PIK3C3表達(dá)，也減少不溶性SQSTM1在TAA處理肝臟中的聚集，不影響可溶性SQSTM1的水平。這些數(shù)據(jù)表明TRIB3通過(guò)抑制自噬來(lái)介導(dǎo)肝纖維化。

3.TRIB3與SQSTM1相互作用以阻止肝細(xì)胞中晚期內(nèi)體的自噬降解
      饑餓的原代小鼠肝細(xì)胞TRIB3和SQSTM1有關(guān)系，在肝細(xì)胞中共表達(dá)SQSTM1和 LC3，不管有沒(méi)有TRIB3，SQSTM1都能與LC3共沉淀，這個(gè)相互作用能被TRIB3的過(guò)表達(dá)減弱。原代肝細(xì)胞過(guò)表達(dá)TRIB3增強(qiáng)LC3-II：LC3-I，BECN1，PIK3C3和SQSTM1的表達(dá)和不溶性SQSTM1的聚集。
      為確認(rèn)TRIB3在抑制自噬流中的作用，LC3的腺病毒感染肝細(xì)胞測(cè)定自噬流，基于溶酶體GFP猝滅的概念。饑餓細(xì)胞后檢測(cè)到RFP-GFP-LC3為紅色斑點(diǎn)，而TRIB3過(guò)表達(dá)增加黃色斑點(diǎn)的存在和動(dòng)態(tài)移動(dòng)，TRIB3表達(dá)升高增加自噬體、MVB的數(shù)量。量化多泡體MVB分布，測(cè)量核周溶血磷脂酸（LBPA），LBPA +區(qū)域被定義為位于核心2μm范圍內(nèi)。與對(duì)照肝細(xì)胞相比，CQ處理細(xì)胞和TRIB3過(guò)表達(dá)細(xì)胞均表現(xiàn)出核周LBPA +片段增加和LBPA +斑點(diǎn)尺寸擴(kuò)大。使用CD63和溶酶體標(biāo)記LAMP1（溶酶體相關(guān)膜蛋白1）免疫染色精確界定CQ處理或TRIB3過(guò)表達(dá)的肝細(xì)胞細(xì)胞器的改變，CD63和LAMP1的共定位在肝細(xì)胞中增強(qiáng)，而CQ治療或TRIB3過(guò)表達(dá)顯著減少這種共定位。

4.TRIB3促進(jìn)肝細(xì)胞的外泌體分泌
      鑒于自噬功能障礙是一個(gè)外泌體釋放的關(guān)鍵因素，推斷TRIB3介導(dǎo)的抑制自噬流的變化可導(dǎo)致肝細(xì)胞外泌體分泌增強(qiáng)。ESCRT（內(nèi)體運(yùn)輸所需的分選復(fù)合物） 對(duì)MVB的形成和MVB來(lái)源外泌體的分泌至關(guān)重要，TRIB3過(guò)表達(dá)肝細(xì)胞表現(xiàn)出TSG101（腫瘤易感性101 [ESCRT-I的亞基]）水平顯著增加。共感染Tsg101和Sqstm1的肝細(xì)胞，在TRIB3過(guò)表達(dá)的肝細(xì)胞中TSG101與SQSTM1共定位增加。沉默Trib3促進(jìn)CHX處理的肝細(xì)胞中TSG101和SQSTM1的降解，自溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1也有可以降解這兩個(gè)分子。為確認(rèn)TRIB3參與的外泌體釋放，從Trib3感染肝細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離外泌體，并用動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)鑒定，檢測(cè)TRIB3過(guò)表達(dá)肝細(xì)胞上清液中外泌體的數(shù)量增加。TRIB3-過(guò)表達(dá)肝細(xì)胞外泌體標(biāo)志物如TSG101，HSPA8 / HSC70，和GAPDH以及TRIB3和SQSTM1的表達(dá)增加，能被Tsg101缺失逆轉(zhuǎn)。

4.TRIB3通過(guò)肝細(xì)胞衍生的外泌體激活HSC（肝星狀細(xì)胞）
      用過(guò)表達(dá)TRIB3肝細(xì)胞的外泌體（HepaTRIB3-外泌體）處理HSCs，可看到HSC顯著激活，增殖和遷移。200個(gè)細(xì)胞因子抗體在HepaTRIB3-外泌體中鑒定潛在的HSC激活劑，發(fā)現(xiàn)有175種蛋白質(zhì)沒(méi)有表達(dá)變化或低表達(dá)，16種蛋白質(zhì)下調(diào)，9種蛋白質(zhì)上調(diào)。從肝細(xì)胞中分離的外泌體處理HSC，大部分外泌體被HSC吞噬（圖5E）。INHBA是HepaTRIB3外泌體中最豐富的細(xì)胞因子，Inhba敲低肝細(xì)胞分泌的外泌體降低HSC中ACTA2和COL1A1的表達(dá)。

5. 融合肽Pep2-A2能打亂TRIB3和SQSTM1的相互作用并且回復(fù)自噬
      融合肽Pep2-A2處理抑制過(guò)表達(dá)TRIB3和SQSTM1的肝細(xì)胞中的相互作用和共定位和SQSTM1，用Pep2-A2預(yù)處理肝細(xì)胞恢復(fù)TRIB3抑制的自噬通量，減少培養(yǎng)基中外泌體的數(shù)量，消除HepaTRIB3-外泌體的HSC激活作用，HSC中的分化轉(zhuǎn)移信號(hào)蛋白MMP2和MMP9也減少。

6. 破壞TRIB3-SQSTM1相互作用會(huì)減少肝臟纖維化
      評(píng)估Pep2-A2在BDL-或TAA誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型中的作用。Pep2-A2治療小鼠顯著降低BDL誘導(dǎo)肝纖維化（肝臟形態(tài)和膠原沉積改善），肝臟促纖維化基因的表達(dá)和羥脯氨酸含量也降低，纖維化肝組織中TRIB3與SQSTM1共定位減少。Pep2-A2處理小鼠中自噬體和MVBs減少，膠原沉積和ACTA2表達(dá)減少，羥脯氨酸和Col1a1 mRNA表達(dá)減少。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了破壞TRIB3-SQSTM1相互作用，通過(guò)恢復(fù)受阻的自噬通量，來(lái)發(fā)揮有效的肝纖維化治療效果。

總結(jié)：1. TRIB3表達(dá)與肝纖維化密切相關(guān)
         2. TRIB3與SQSTM1相互作用減弱自噬
        3. TRIB3促進(jìn)肝細(xì)胞的外泌體分泌增多，進(jìn)而可以激活HSC細(xì)胞
       4.破壞TRIB3-SQSTM1相互作用會(huì)減少肝臟纖維化
      肝纖維化的進(jìn)程是一個(gè)非常復(fù)雜而漸進(jìn)的過(guò)程，受到多種分子及細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。盡管目前對(duì)肝纖維化的研究已取得初步的進(jìn)展，其確切的機(jī)制及尋找其治療靶點(diǎn)仍需深入探討。