lncRNA LINC00673-v4通過激活WNT/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)肺腺癌的侵襲性
肺癌是最常見的癌癥類型，非小細(xì)胞肺癌占肺癌的比例約為85％，肺腺癌（LAD）占非小細(xì)胞肺癌50%左右。轉(zhuǎn)移可在LAD早期階段發(fā)生，但驅(qū)動(dòng)這種快速轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制仍未完全了解。最近來自廣東中山大學(xué)的團(tuán)隊(duì)在期刊PNAS上發(fā)表了一篇題名為：Long noncoding RNA LINC00673-v4 promotes aggressiveness of lung adenocarcinoma via activating WNT/β-catenin signaling的文章。該文章主要講述了lncRNA LINC00673-v4表達(dá)在LAD中上調(diào)并且與腫瘤侵襲進(jìn)展的關(guān)系。
一、LINC00673-v4表達(dá)在LAD中上調(diào)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)
通過他人在TCGA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的整合分析，確定了關(guān)于WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)10種最高表達(dá)的lncRNA。使用熒光素酶測(cè)定法，評(píng)估了10種高表達(dá)的lncRNA轉(zhuǎn)錄物在LAD中的作用。沉默ENST00000457958.6導(dǎo)致LAD細(xì)胞中TCF / LEF活性的顯著抑制，而ENST00000457958.6與LINC00673-v4(NCBA)序列100%相同。使用FISH和細(xì)胞分離分析，在LAD細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了LINC00673-v4大量存在。分析編碼潛力表示LINC00673-V4可能顯著缺乏蛋白質(zhì)編碼能力。與原發(fā)性正常肺上皮細(xì)胞相比，LAD細(xì)胞系中LINC00673-v4的表達(dá)升高。通過qRT-PCR驗(yàn)證分析LAD和癌旁組織中的LINC00673-v4水平，發(fā)現(xiàn)LAD LINC00673-v4表達(dá)顯著高于癌旁組織。大組織樣本量qRT-PCR驗(yàn)證LAD和正常肺組織中的LINC00673-v4表達(dá)，結(jié)果同上。生存曲線分析顯示LINC00673-v4低表達(dá)較高表達(dá)生存率有顯著提升。
二、LINC00673-v4促進(jìn)LAD細(xì)胞入侵，遷移和轉(zhuǎn)移
LINC00673-v4表達(dá)與LN轉(zhuǎn)移和LAD預(yù)后不良的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)，那么LINC00673-v4是否能夠促進(jìn)LAD細(xì)胞的侵襲和遷移。在體外細(xì)胞系驗(yàn)證中，transwell結(jié)果顯示LINC00673-v4的過表達(dá)顯著增加了LAD細(xì)胞的侵襲和遷移能力，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果同上；當(dāng)敲低LINC00673-v4是抑制細(xì)胞侵襲和遷移。
利用裸鼠肺癌轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮隗w內(nèi)檢查L(zhǎng)INC00673-v4的功能，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。為了進(jìn)一步證實(shí)LINC00673-v4在LAD轉(zhuǎn)移中的功能，采用心內(nèi)注射轉(zhuǎn)移模型。LINC00673-V4過表達(dá)的PC9細(xì)胞接種的小鼠中顯著增加骨和腦轉(zhuǎn)移，但敲低LINC00673-V4 PC9細(xì)胞降低。還利用LINC00673-v4的反義RNA鏈（LINC00673-v4 GapmeRs）直接注射到裸鼠尾靜脈來治療LAD轉(zhuǎn)移模型，治療組腫瘤轉(zhuǎn)移性明顯下降。結(jié)果表明LINC00673-v4 GapmeRs代表了LAD轉(zhuǎn)移的潛在治療方法。這些數(shù)據(jù)表明LINC00673-v4是LAD細(xì)胞侵襲，遷移和轉(zhuǎn)移的強(qiáng)啟動(dòng)子分子。
三、LINC00673-v4激活WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)
為了進(jìn)一步闡明LINC00673-v4在WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，分別在LINC00673-v4過表達(dá)和敲低的LAD細(xì)胞中進(jìn)行熒光素酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)。TCF / LEF活性過表達(dá)LINC00673-V4細(xì)胞中顯著增加，并且在敲低LINC00673-V4細(xì)胞中顯著降低。LINC00673-V4的過表達(dá)促進(jìn)β連環(huán)蛋白的細(xì)胞核積聚，而敲低LINC00673-V4抑制β連環(huán)蛋白細(xì)胞核積聚。接下來檢查了LINC00673-v4對(duì)WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)下游入侵相關(guān)基因表達(dá)的影響。VEGF、HOXB9、Twist和MMP9表達(dá)水平，在過表達(dá)LINC00673-V4細(xì)胞中顯著增加，并且在敲低LINC00673-V4細(xì)胞中顯著降低。
接下來研究了WNT /β-連環(huán)蛋白激活是否在介導(dǎo)LINC00673-v4誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲中發(fā)揮作用。首先，通過敲低TCF4或LEF1抑制WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)LINC00673-v4過表達(dá)細(xì)胞侵襲的影響，LINC00673-V4過表達(dá)的細(xì)胞侵襲時(shí)因TCF4或LEF1被敲低而減弱。TCF4或LEF1敲低導(dǎo)致細(xì)胞侵襲減少，但不如過表達(dá)LINC00673-v4的LAD細(xì)胞顯著。其次，在LINC00673-v4敲除的細(xì)胞系中驗(yàn)證TCF4或LEF1過表達(dá)拯救LAD細(xì)胞侵襲的能力。在過表達(dá)TCF4或LEF1空載體轉(zhuǎn)染的LAD細(xì)胞中，增加了LAD細(xì)胞侵襲，并且這些影響可能在LINC00673-V4-沉默LAD細(xì)胞中進(jìn)一步增強(qiáng)。最后通過使用WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑進(jìn)一步確定活化的WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)是否在小鼠模型中在LINC00673-v4介導(dǎo)的前期轉(zhuǎn)移作用中發(fā)揮作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)nt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑ICG-001對(duì)PC9-LINC00673-v4和PC9-Vector轉(zhuǎn)移能力下降明顯。但I(xiàn)CG-001對(duì)PC9載體細(xì)胞肺接種成瘤的抑制作用不如過表達(dá)LIN900673-v4的PC9細(xì)胞。這些結(jié)果表明，LINC00673-v4可促進(jìn)WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的活性，從而增強(qiáng)LAD細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
四、LINC00673-v4與DDX3和CK1ε互作
許多l(xiāng)ncRNA通過與蛋白質(zhì)分子的物理相互作用發(fā)揮其生物學(xué)功能。為了研究LINC00673-v4在調(diào)節(jié)WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)中的作用的分子機(jī)制，通過鑒定LINC00673-v4的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白開始研究。將生物素化的LINC00673-v4或其反義RNA與PC9細(xì)胞裂解物一起溫育，然后進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)。對(duì)差異條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析， CK1ε是4個(gè)差異條帶中排名靠前的LINC00673-v4相互作用蛋白，也在WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。為了證實(shí)LINC00673-v4與CK1ε相互作用，我們使用CK1ε抗體進(jìn)行RNA pull-down和免疫印跡，結(jié)果顯示在LINC00673-v4蛋白復(fù)合物中檢測(cè)到CK1ε，但在對(duì)照樣品中未檢測(cè)到CK1ε。而且，在UV交聯(lián)后通過RIP測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證了直接相互作用。進(jìn)行RNA pull-down之后進(jìn)行后UV交聯(lián)免疫印跡和RIP測(cè)定，結(jié)果表明，LINC00673-V4也直接與DDX3相互作用。
為了確定LINC00673-v4的分子內(nèi)區(qū)域與相互作用中涉及的兩種蛋白質(zhì)相互作用，LINC00673-v4的八個(gè)片段（1-1728 nt，1-1296 nt，1-864 nt，1-432 nt，1729-2189 nt ，1297-2189 nt，865-2189 nt和433-2189 nt體外轉(zhuǎn)錄和生物素化，并用于來自PC9細(xì)胞的總蛋白質(zhì)提取物的pull-down測(cè)定。發(fā)現(xiàn)LINC00673-V4的1729-2160個(gè)核苷酸段與DDX3相互作用，而LINC00673-V4的1-432 NT段與CK1ε相互作用。這些數(shù)據(jù)表明LINC00673-v4是DDX3和CK1ε的直接交互結(jié)合配偶體。
五、LINC00673-v4在WNT /β-Catenin信號(hào)通路中作為模塊化支架起作用
為了進(jìn)一步了解LINC00673-v4與DDX3和CK1ε的結(jié)合是否加強(qiáng)了DDX3和CK1ε之間的相互作用，進(jìn)行了o-IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DDX3和CK1ε可以相互作用并且過表達(dá)LINC00673- V4增強(qiáng)DDX3和CK1ε的相互作用，而LINC00673-v4敲低減弱了LAD細(xì)胞系中的這種相互作用，表明LINC00673-v4直接結(jié)合DDX3和CK1ε并加強(qiáng)它們的相互作用。
為了驗(yàn)證LINC00673-v4是否與DDX3和CK1ε相互作用是激活WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)所必需的。在過表達(dá)LINC00673-v4的LAD細(xì)胞中敲除了DDX3或CK1ε，發(fā)現(xiàn)通過敲除DDX3或CK1ε可以抑制LINC00673-v4誘導(dǎo)的WNT /β-連環(huán)蛋白激活和LAD細(xì)胞侵襲能力的增加。還研究了敲低DDX3或CK1ε對(duì)對(duì)照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的影響。DDX3或CK1ε敲低導(dǎo)致對(duì)照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中WNT /β-連環(huán)蛋白激活和細(xì)胞侵襲減少，但不如過表達(dá)LINC00673-v4的LAD細(xì)胞顯著。還觀察到DVL的磷酸化在LINC00673-V4過表達(dá)LAD細(xì)胞增加，而沉默LINC00673-V4表達(dá)降低DVL磷酸化?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明LINC00673-v4可能確實(shí)充當(dāng)DDX3和CK1ε復(fù)合物的模塊化支架以激活WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。
六、LINC00673-v4與LAD中的WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)臨床相關(guān)
進(jìn)一步研究上述發(fā)現(xiàn)是否與臨床相關(guān)，我們采用LAD臨床標(biāo)本檢查L(zhǎng)INC00673-v4的表達(dá)及其與WNT /β-連環(huán)蛋白激活標(biāo)志的相關(guān)性。LINC00673-V4水平和核β連環(huán)蛋白（R = 0.238，P = 0.009）、Twist (r = 0.205, P = 0.025)、HOXB9 (r = 0.197, P = 0.032)、MMP9 (r = 0.191, P = 0.038)和 VEGF (r = 0.202, P = 0.028) 的表達(dá)正相關(guān)。此外，分析了在TANRIC數(shù)據(jù)庫中收集的LAD患者的數(shù)據(jù)，LINC00673-v4高表達(dá)與Twist 、HOXB9、MMP9和 VEGF 成正相關(guān)。這表明在LAD病人，LINC00673-V4臨床有助于WNT的激活/ β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，導(dǎo)致核β-連環(huán)蛋白，VEGF，Twist，HOXB9和MMP9的表達(dá)增加。
結(jié)論
NC00673-v4在LAD中的臨床，功能和機(jī)制意義，LINC00673-v4及其在WNT /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)中的調(diào)節(jié)作用對(duì)于LAD的侵襲性行為至關(guān)重要，而LINC00673-v4可能是一種LAD治療潛在的有效目標(biāo)。