看METTL3介導(dǎo)的m6A如何作用于胃癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移
N6-甲基腺苷（m6A）修飾是真核mRNA中最常見(jiàn)的化學(xué)修飾之一，對(duì)mRNA的穩(wěn)定性，剪接和翻譯產(chǎn)生重要影響。最近，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到m6A在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。然而，m6A的失調(diào)及其在腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和轉(zhuǎn)移中的功能仍然不清楚。該研究采用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胃癌（GC）中METTL3的表達(dá)。通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)研究了METTL3對(duì)GC轉(zhuǎn)移的影響。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，m6A測(cè)序，m6A甲基化RNA免疫定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（MeRIP qRT-PCR），共聚焦免疫熒光測(cè)定，熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定，共免疫沉淀，RNA免疫沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)定等方法探索了METTL3的作用機(jī)理。
結(jié)果：
一、METTL3過(guò)表達(dá)及其在GC中的預(yù)后價(jià)值
通過(guò)臨床數(shù)據(jù)集TCGA（癌癥基因組圖譜）和GSE66229，發(fā)現(xiàn)GC組織中METTL3 mRNA表達(dá)顯著升高，胃癌組織中METTL14表達(dá)降低，且兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的其他m6A“writers” 和 “erasers”水平不一致（圖1a，b）。qRT-PCR驗(yàn)證了由60對(duì)GC組織中METTL3的mRNA水平明顯過(guò)表達(dá)（圖1c），METTL3在晚期（III-IV）的GC組織中明顯更高（圖1d），GC組織中觀察到m6A mRNA的水平升高（圖1e）。免疫組化檢查了120例的GC組織微陣列樣品中METTL3的蛋白水平。METTL3顯著地定位在GC細(xì)胞核中(圖1f)。Kaplan-Meier曲線顯示，具有METTL3高表達(dá)的患者表現(xiàn)出較差的總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）（圖1g，h）?？傊?，METTL3在GC中明顯過(guò)表達(dá)，可能與GC進(jìn)展有關(guān)。
二、EMT需要METTL3
免疫組化連續(xù)切片染色顯示GC組織中METTL3的表達(dá)水平似乎與E-鈣粘蛋白負(fù)相關(guān)，而與N-鈣粘蛋白和波形蛋白正相關(guān)（圖2a）。MKN-28細(xì)胞系顯示E-鈣粘蛋白的高表達(dá)，而N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平低，這是其上皮表型的代表（圖2b）。為驗(yàn)證EMT程序是否需要METTL3，進(jìn)行了功能喪失和功能獲得研究（圖2c，d）。敲低METTL3會(huì)導(dǎo)致N-鈣粘蛋白和波形蛋白的顯著下調(diào)，同時(shí)在BGC823和AGS細(xì)胞中蛋白質(zhì)水平上E-鈣粘蛋白的顯著上調(diào)。METTL3的過(guò)表達(dá)在MKN-28細(xì)胞中引起相反的結(jié)果（圖2e），METTL3的敲低或過(guò)表達(dá)分別也降低或增加了GC細(xì)胞中總體m6A修飾水平（圖2f，g）?？傊?，METTL3促進(jìn)了GC細(xì)胞中的EMT程序。
三、METTL 3促進(jìn)胃癌細(xì)胞在體內(nèi)外的侵襲和轉(zhuǎn)移
通過(guò)傷口愈合實(shí)驗(yàn)顯示METTL 3表達(dá)的減弱明顯抑制了BGC 823細(xì)胞的遷移能力(圖3a)，METTL 3的強(qiáng)制表達(dá)明顯增加了MKN-28細(xì)胞的遷移速度(圖3b)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除METTL 3基因后，GC細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制(圖 3C)，而METTL 3的異位表達(dá)則顯著地增強(qiáng)了它的表達(dá)(圖3d)。研究發(fā)現(xiàn)BGC 823-shRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裸鼠肺部的效果不如對(duì)照組(圖3e，f)。METTL 3的過(guò)表達(dá)明顯增加了MKN-28細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)(圖3g，h)。小鼠原位模型實(shí)驗(yàn)，在裸鼠胃漿膜下注射穩(wěn)定的MKN-28細(xì)胞，GC細(xì)胞植入后5周觀察腫瘤浸潤(rùn)肌層和粘膜發(fā)現(xiàn)METTL 3高表達(dá)組的腫瘤比對(duì)照組大。此外，METTL 3過(guò)表達(dá)組可觀察到肝轉(zhuǎn)移灶，但不在對(duì)照中（圖3i-k）。表明METTL3在促進(jìn)GC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。
四、轉(zhuǎn)錄組-測(cè)序和m6A-測(cè)序鑒定ZMYM 1是METTL 3的直接靶點(diǎn)
通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較在BGC 823細(xì)胞中敲除METTL 3后的基因表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)798個(gè)基因被顯著下調(diào)，662個(gè)基因被顯著上調(diào)(圖4a，b)。通過(guò)m6A測(cè)序鑒定了9465和8794 m6A峰對(duì)照和METTL3-缺陷細(xì)胞（圖4c)。在BGC823細(xì)胞中，METTL3穩(wěn)定敲低，發(fā)現(xiàn)850個(gè)峰減少(圖4d)。在BGC 823細(xì)胞中映射m6A甲基體時(shí)，在免疫純化的RNA中，m6A共識(shí)序列GGAC（R RACH）基序在m6A位點(diǎn)中高度富集（圖4e）。與以前的研究一致，我們證明了m6A信號(hào)。 L在mRNAs的終止密碼子附近富集(圖4f)。用798個(gè)下調(diào)的基因過(guò)濾掉850個(gè)減少的m6A峰，從而鑒定出由13個(gè)基因帶來(lái)的15個(gè)峰（圖4g）。在這13個(gè)潛在的調(diào)節(jié)因子中，我們的重點(diǎn)是ZMYM1，因?yàn)樵趕h-NC BGC823細(xì)胞中在其mRNA的終止密碼子附近檢測(cè)到兩個(gè)m6A峰，并且在METTL3敲低后均被減弱（圖4h）。ZMYM 1的生物學(xué)功能尚不清楚，因此選擇了ZMYM1作為METTL 3介導(dǎo)的m6A修飾的候選靶點(diǎn)。
五、METTL 3在GC中維持ZMYM 11的表達(dá)
與基因表達(dá)數(shù)據(jù)一致，分別在mRNA和蛋白水平上ZMYM1的表達(dá)被下調(diào)或上調(diào)的METTL3的敲低或過(guò)表達(dá)(圖5a-d)。免疫熒光染色顯示ZMYM 1的核定位及METTL3的缺失誘導(dǎo)BGC 823細(xì)胞ZMYM 1的表達(dá)損失，而過(guò)表達(dá)METTL 3則增加MKN-28細(xì)胞的ZMYM 1水平(圖5e)。qRT-PCR驗(yàn)證了隊(duì)列1中ZMYM1的表達(dá)。 在這個(gè)樣本人群中，ZMYM1表達(dá)經(jīng)常在GC組織中升高，并與METTL3表達(dá)正相關(guān)（圖5f，g）。 通過(guò)共聚焦成像也證實(shí)了METTL3和ZMYM1在GC組織中的核共定位（圖5h）。數(shù)據(jù)表明，METTL 3正調(diào)控ZMYM 1在GC中的表達(dá)。
六、METTL 3通過(guò)m6A-Hur依賴途徑增強(qiáng)ZMYM 1 mRNA表達(dá)
MERIP、qRT-PCR對(duì)m6A測(cè)序數(shù)據(jù)集進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果抗m6A抗體顯著富集胃癌細(xì)胞中ZMYM1 mRNA水平的變化。METTL 3的敲除或過(guò)表達(dá)顯著降低或增加了ZMYM1 mRNA的m6A水平(圖6a，b)。突變體ZMYM 1的m6A修飾因m6A一致序列(RACH)中的胞嘧啶取代腺苷堿而被取消(圖6c)。熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)表明，野生型ZMYM 1的轉(zhuǎn)錄水平不高，突變體在沒(méi)有METTL 3的情況下顯著降低(圖6d)。METTL 3過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了野生型ZMYM 1融合報(bào)告基因的表達(dá)，顯示ZMYM 1水平的調(diào)控受METTL 3相關(guān)m6A修飾的控制(圖6e)。HuR結(jié)合位點(diǎn)位于ZMYM1的m6A修飾區(qū)域，這是由我們的m6A測(cè)序所揭示的（圖4f）。使用抗HuR抗體的RIP-qPCR顯示，在METTL3沉默的BGC823細(xì)胞中，HuR對(duì)ZMYM1 mRNA的親和力大大降低，而在MKN-28細(xì)胞中，METTL3的過(guò)表達(dá)則顯示出相反的結(jié)果（圖6f，g）。經(jīng)修飾的METTL 3表達(dá)后，所有GC細(xì)胞的Hur表達(dá)情況均無(wú)明顯變化(圖6~j)。揭示了METTL 3介導(dǎo)的m6A修飾通過(guò)m6A-Hur依賴性途徑增強(qiáng)ZMYM 1的表達(dá)。
七、ZMYM 1與核內(nèi)的CtBP/LSD 1/COREST復(fù)合物有物理聯(lián)系
鋅指家族蛋白參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們將全長(zhǎng)ZMYM 1融合到gal 4的DNA結(jié)合區(qū)，并測(cè)試了其在GC細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果表明，標(biāo)記ZMYM1在BGC823和MKN-28細(xì)胞中均以劑量依賴性方式顯著抑制報(bào)告基因的活性(圖7a，b)。ZMYM1的過(guò)表達(dá)根本不影響Gal4驅(qū)動(dòng)的報(bào)道分子的活性（圖7c），這表明ZMYM1與DNA物理結(jié)合，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制活性。IP用抗ZMYM1的抗體進(jìn)行IP免疫，然后用抗CtBP / LSD1 / CoREST復(fù)合物成分的抗體進(jìn)行免疫印跡，證明ZMYM1與所有測(cè)試的蛋白質(zhì)都有相互作用（圖7d，e）。相反，用抗CtBP1 / 2，LSD1或CoR EST抗體進(jìn)行IP免疫接種，然后用抗ZMYM1抗體進(jìn)行免疫印跡也證實(shí)ZMYM1被該復(fù)合物的所有組分有效地免疫共沉淀（圖7f）。結(jié)果表明ZMYM1在物理上與CtBP / LSD1 / CoREST復(fù)合體相關(guān)。
八、ZMYM 1相關(guān)復(fù)合物對(duì)E-鈣粘素的轉(zhuǎn)錄抑制作用
實(shí)驗(yàn)中，對(duì)CRS上所有復(fù)雜組分的富集進(jìn)行了驗(yàn)證（圖7g)。此外，ZMYM1、CTBP1、LSD1和COREST的共同占有 在E-cadherin啟動(dòng)子上，通過(guò)重新芯片分析(圖7H)確定了E-cadherin啟動(dòng)子。為了進(jìn)一步證實(shí)ZMYM 1相關(guān)復(fù)合物對(duì)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制作用，我們進(jìn)行了WB分析。 裂解并發(fā)現(xiàn)ZMYM1的增益-功能伴隨E-cadherin的降低表達(dá)。顯著地，在CTB中，ZMYM1過(guò)表達(dá)引起的E-cadherin的衰減被取消。 P1，LSD 1，或支柱被擊倒(圖7i)。數(shù)據(jù)表明，ZMYM 1通過(guò)與CtBP/LSD 1/Corest復(fù)合物結(jié)合，靶向和抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。
九、METTL 3介導(dǎo)的ZMYM 1表觀遺傳激活與胃癌的EMT和轉(zhuǎn)移有關(guān)
在MYTTL3敲低細(xì)胞中，ZMYM1表達(dá)的升高概括了N鈣粘蛋白和波形蛋白的水平，并降低了E鈣粘蛋白的表達(dá)(圖8a)。相反，抑制ZMYM1至少部分抵消了METTL3過(guò)表達(dá)引起的EMT進(jìn)程加速（圖8b）。 Transwell入侵試驗(yàn)表明，敲低METTL3降低了GC細(xì)胞的侵襲能力，而ZMYM1的異位表達(dá)挽救了這種能力（圖8c，e）。相反，過(guò)表達(dá)METTL3可增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力，與sh-ZMYM1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染可部分減弱細(xì)胞侵襲能力（圖8d，f）。對(duì)于肺轉(zhuǎn)移模型，觀察到相似的結(jié)果。引入ZMYM1可以至少部分抵消METTL3敲低對(duì)轉(zhuǎn)移的抑制作用，而與METTL3過(guò)表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)移潛能的增加則可以通過(guò)ZMYM1的耗盡而部分減弱（圖8g，h）。此外，根據(jù)免疫組織化學(xué)結(jié)果，ZMYM1的蛋白水平隨著肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)的減少而降低，并因修飾的METTL3表達(dá)引起的更多的肺定植而被上調(diào)（圖8i，j）。表明ZMYM1的過(guò)表達(dá)與METTL3介導(dǎo)的EMT和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
結(jié)論：
m6A修飾在GC中的關(guān)鍵作用，并發(fā)現(xiàn)METTL3 / ZMYM1 / E-鈣粘蛋白信號(hào)傳導(dǎo)是針對(duì)GC的抗轉(zhuǎn)移策略的潛在治療靶標(biāo)。