腫瘤轉(zhuǎn)移新機(jī)制：外泌體PMK2影響轉(zhuǎn)移前微環(huán)境

    早中期前列腺癌（PCa）的預(yù)后還比較可觀，但是晚期的PCa預(yù)后較差，五年總體生存率較低，尤其是轉(zhuǎn)移性PCa的死亡率較高。然而，PCa選擇性骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未可知。本文子在研究背景下出發(fā)發(fā)現(xiàn)了一種外泌體介導(dǎo)的PCa選擇性骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，并于2019年12月發(fā)表在期刊journal of experimental medicine (IF: 10.892)上。
主要結(jié)果如下：
1、前列腺癌來(lái)源的外泌體促進(jìn)小鼠骨腫瘤的生長(zhǎng)
    從PC3細(xì)胞系分離得到的外泌體如圖1所示。

                                                                      圖1 外泌體的分離與鑒定
    使用上述外泌體注射小鼠左心室21天，圖2A和B顯示PCa來(lái)源外泌體處理組的腫瘤負(fù)荷和轉(zhuǎn)移部分都顯著高于對(duì)照組、健康組和無(wú)外泌體處理組。并且，經(jīng)外泌體預(yù)處理后的骨髓細(xì)胞中能檢測(cè)到更多的前列腺癌細(xì)胞（圖2 C）。靜脈注射GFP標(biāo)記的PCa來(lái)源外泌體，24小時(shí)后在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)的熒光圖片（圖2 D）。前列腺原位注射GFP標(biāo)記的PCa來(lái)源外泌體，21天后在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞檢測(cè)的熒光圖片（圖2 E）。此外，檢測(cè)了其它組織中是否有前列腺癌細(xì)胞的的轉(zhuǎn)移，結(jié)果如預(yù)期，在骨髓中轉(zhuǎn)移最多（圖2 G）。以上說(shuō)明PCa外泌體并不直接作用于PCa細(xì)胞，而是通過(guò)遠(yuǎn)端靶微環(huán)境間接靶向和促進(jìn)PCa進(jìn)展，對(duì)骨髓有靶向選擇性。

                                                               圖2前列腺癌來(lái)源的外泌體促進(jìn)小鼠骨腫瘤的生長(zhǎng)

2、前列腺癌來(lái)源的外泌體可以誘導(dǎo)骨基質(zhì)細(xì)胞增加PCa腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲
    為了研究外泌體是否通過(guò)微環(huán)境間接促進(jìn)PCa進(jìn)展，我們?cè)u(píng)估了外泌體改變BMSCs影響PCa細(xì)胞生長(zhǎng)能力的程度。分別使用新鮮培養(yǎng)基、C4-2B細(xì)胞外泌體、ST2細(xì)胞條件培養(yǎng)基、C4-2B細(xì)胞外泌體處理ST2細(xì)胞48小時(shí)后的條件培養(yǎng)基處理PC3和LNCaP細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未經(jīng)外泌體處理的培養(yǎng)基并不能促進(jìn)PCa細(xì)胞生長(zhǎng)，相反，外泌體預(yù)處理后的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基可以促進(jìn)PCa細(xì)胞生長(zhǎng)（圖3A）。因此，作者推測(cè)，外泌體通過(guò)改變基質(zhì)細(xì)胞來(lái)促進(jìn)PCa細(xì)胞生長(zhǎng)。
    為進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)，將PCa細(xì)胞皮下移植到?jīng)]有基質(zhì)細(xì)胞或相反側(cè)腹有基質(zhì)細(xì)胞的膠原海綿上，然后用空載體或PCa外泌體處理小鼠。單獨(dú)的外泌體和基質(zhì)細(xì)胞均不影響PCa的生長(zhǎng)，而在基質(zhì)細(xì)胞負(fù)載的海綿中，外泌體誘導(dǎo)了PCa的生長(zhǎng)(圖3B)。這些結(jié)果為體內(nèi)外泌體調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)PCa生長(zhǎng)提供了證據(jù)。為確定外泌體介導(dǎo)的對(duì)基質(zhì)細(xì)胞的影響是否只針對(duì)成纖維細(xì)胞間質(zhì)或擴(kuò)展到其他骨髓細(xì)胞成分研究了PCa外泌體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞調(diào)節(jié)PCa生長(zhǎng)能力的影響，結(jié)果顯示，外泌體對(duì)成纖維細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞的作用最強(qiáng)，其次是成骨細(xì)胞，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞或破骨細(xì)胞無(wú)影響(圖3C)。為了確定外泌體介導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)是否擴(kuò)展到PCa進(jìn)展的其他方面，評(píng)估了它們對(duì)PCa細(xì)胞侵襲性的影響，基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基單獨(dú)作用可促進(jìn)PCa的侵襲，然而，經(jīng)PCa細(xì)胞外泌體預(yù)處理的基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)一步增強(qiáng)了PCa細(xì)胞的侵襲能力(圖3 D)。

                                                     圖3 PCa來(lái)源的外泌體可以誘導(dǎo)骨基質(zhì)細(xì)胞增加PCa腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲
    以上結(jié)果均是使用小鼠間質(zhì)細(xì)胞系，作者進(jìn)一步探究了是否在人的基質(zhì)細(xì)胞系中也有相同的作用。因此，重復(fù)幾次使用HS-5人骨髓干細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)，得出了類(lèi)似的結(jié)論，如圖4所示。這些結(jié)果表明，來(lái)源于PCa的外泌體對(duì)骨髓基質(zhì)的影響能夠促進(jìn)PCa的進(jìn)展。

                                                  圖4 PCa來(lái)源外泌體培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增加PCa腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲

3、PCa來(lái)源外泌體增加了基質(zhì)細(xì)胞中PKM2的表達(dá)和C-X-C基序趨化配體12 (CXCL12)的產(chǎn)生
    為了探索外泌體誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)形成腫瘤表型的機(jī)制，進(jìn)行了蛋白組測(cè)序，在未處理細(xì)胞和外泌體處理細(xì)胞中篩選到超過(guò)30個(gè)差異表達(dá)蛋白。其中PKM2的差異最為顯著，并且它是一種關(guān)鍵的生物學(xué)功能調(diào)節(jié)酶。因此，以PKM2為研究目標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，PCa外泌體可以增加患者和細(xì)胞系中PKM2在ST2細(xì)胞和原代BMSC中的表達(dá)水平(圖5 A-C)。這說(shuō)明，外泌體不誘導(dǎo)PKM2 mRNA的轉(zhuǎn)錄而是將PKM2蛋白從外泌體轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞并/或內(nèi)源性誘導(dǎo)PKM2向基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。為了確定外泌體是否在基質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)PKM2蛋白的合成，使用蛋白合成抑制劑CHX處理基質(zhì)細(xì)胞。在有或沒(méi)有CHX的情況下，PCa來(lái)源的外泌體誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的PKM2水平達(dá)到類(lèi)似的水平(圖5 D)，表明這種增加并不依賴(lài)于蛋白質(zhì)的合成。為了進(jìn)一步證明PKM2是從人類(lèi)PCa細(xì)胞轉(zhuǎn)移到小鼠間質(zhì)細(xì)胞，使用針對(duì)人類(lèi)而非小鼠PKM2的抗體評(píng)估了PKM2在間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。用含有人PKM2的外泌體處理基質(zhì)細(xì)胞(爭(zhēng)奪對(duì)照)可增加人PKM2在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(圖5 E)。綜上所述，這些結(jié)果表明外泌體將PKM2蛋白轉(zhuǎn)移到基質(zhì)細(xì)胞，而不是誘導(dǎo)PKM2 mRNA合成或蛋白合成。

                                                              圖5 PCa來(lái)源的外泌體將PKM2蛋白轉(zhuǎn)移到BMSCs
    之后，探究PKM2是否是外泌體介導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)PCa細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。作者在PCa細(xì)胞中敲低PKM2以創(chuàng)建PKM2缺陷型外泌體，并測(cè)試其誘導(dǎo)促腫瘤發(fā)展的能力。圖6A證實(shí)敲低PKM2會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生缺乏PKM2的外泌體（圖6A）。進(jìn)一步地，PKM2缺失的外泌體沒(méi)有改變ST2基質(zhì)細(xì)胞中PKM2蛋白的表達(dá)(圖6B)。上述表明PKM2蛋白是轉(zhuǎn)移到基質(zhì)細(xì)胞，而不是由外泌體誘導(dǎo)合成。為了確定PKM2的缺失是否會(huì)影響腫瘤生長(zhǎng)，將PKM2缺失的外泌體處理的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)成條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)癌細(xì)胞系，導(dǎo)致PCa外泌體誘導(dǎo)PCa細(xì)胞生長(zhǎng)能力的喪失(圖6 C)。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)原發(fā)前列腺腫瘤促進(jìn)轉(zhuǎn)移，PKM2促進(jìn)原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果與原發(fā)腫瘤可以通過(guò)外泌體PKM2促進(jìn)轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)相一致。

                                                         圖6 PCa來(lái)源的外泌體通過(guò)PKM2增加基質(zhì)細(xì)胞中CXCL12的產(chǎn)生

4、PCa外泌體通過(guò)PKM2誘導(dǎo)的BMSCs分泌CXCL12促進(jìn)PCa腫瘤生長(zhǎng)
    為了探索PCa外泌體中的PKM2是否通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞中可溶性因子的產(chǎn)生以促進(jìn)PCa的生長(zhǎng)，使用qPCR陣列評(píng)估經(jīng)對(duì)照或PKM2敲除PCa外泌體的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)量。PKM2的下調(diào)改變了幾種細(xì)胞因子的表達(dá)，BMP-4和CXCL12的表達(dá)下降最為明顯(圖7A)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PKM2敲除后對(duì)CXCL12的表達(dá)影響要遠(yuǎn)大于BMP-4（圖7B-C）?？傊?，PKM2顯著增加基質(zhì)細(xì)胞中CXCL12的產(chǎn)生，而對(duì)BMP-4的誘導(dǎo)作用有限。

                                                        圖7 外泌體PKM-2促進(jìn)骨髓基質(zhì)BMP-4和CXCL12的表達(dá)
    為了確定PCa外泌體誘導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞是否通過(guò)CXCL12促進(jìn)PCa細(xì)胞生長(zhǎng)，有或沒(méi)有AMD3100（一種抑制CXCL12結(jié)合其靶標(biāo)CXCR4的物質(zhì)）的條件下，用PCa外泌體處理的基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中孵育PCa細(xì)胞。如前觀察到的，來(lái)自PCa衍生的外來(lái)體處理過(guò)的基質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基增加了PC3和C4-2B細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。但是，AMD3100抑制了這種誘導(dǎo)作用（圖8A和B）。這表明CXCL12有助于外泌體誘導(dǎo)的增殖作用。并驗(yàn)證了CXCL12促進(jìn)PCa細(xì)胞增殖與侵襲依賴(lài)于PKM2。但是，與僅使用PKM2敲除的PCa外泌體相比，AMD3100和PKM2敲除的PCa外泌體的組合作用并沒(méi)有進(jìn)一步抑制增殖或侵襲（圖8C和D）。如圖8E-L所示，在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也驗(yàn)證了上述結(jié)論。綜上所述，PCa外泌體運(yùn)輸?shù)腜KM2調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞中CXCL12的產(chǎn)生以促進(jìn)PCa的生長(zhǎng)和侵襲。

                                            圖8 PCa外泌體通過(guò)PKM2誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞CXCL12表達(dá)促進(jìn)PCa腫瘤生長(zhǎng)

5、PCa外泌體通過(guò)PKM2依賴(lài)方式誘導(dǎo)HIF-1α促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞中CXCL12表達(dá)
    文獻(xiàn)報(bào)道HIF-1α促進(jìn)CXCL12的表達(dá)，因此，作者首先探究了外泌體是否促進(jìn)HIF-1α表達(dá)又是否依賴(lài)于PKM2。結(jié)果顯示PCa來(lái)源的外泌體刺激了ST2基質(zhì)細(xì)胞系和BMSC中HIF-1α mRNA和蛋白水平的表達(dá)，在PKM2敲除的PCa外泌體顯著減少了HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)(圖9A-C)。這些結(jié)果表明，PCa衍生的外來(lái)體以PKM2依賴(lài)的方式促進(jìn)HIF-1α表達(dá)。為了確定外泌體誘導(dǎo)的HIF-1α是否調(diào)節(jié)CXCL12表達(dá)，敲低基質(zhì)細(xì)胞中的HIF-1α，并用外泌體處理，以確認(rèn)HIF-1α表達(dá)的喪失（圖9 D）。然后，用C4-2B PCa衍生的外泌體處理基質(zhì)細(xì)胞，并觀察到基質(zhì)細(xì)胞中HIF-1α的敲低顯著降低了外泌體介導(dǎo)的CXCL12 mRNA和蛋白的表達(dá)（圖9 E）。綜上所述，PCa衍生的外泌體以PKM2依賴(lài)性方式刺激HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)CXCL12表達(dá)。

                                           圖9 PCa來(lái)源的外泌體增加BMSC細(xì)胞中CXCL12表達(dá)通過(guò)PKM2誘導(dǎo)HIF-1α
綜上所述，本文證實(shí)，腫瘤來(lái)源的外泌體介導(dǎo)的PKM2轉(zhuǎn)移是調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境以促進(jìn)CXCL12表達(dá)和PCa骨轉(zhuǎn)移進(jìn)展的關(guān)鍵介質(zhì)?？偟膩?lái)說(shuō)，這項(xiàng)工作提出了一種新穎的機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制，原發(fā)性腫瘤與骨骼微環(huán)境發(fā)生相互作用，從而建立了轉(zhuǎn)移前niche環(huán)境并促進(jìn)PCa骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程。
參考文獻(xiàn)：
    Dai Jinlu., Escara-Wilke June., Keller Jill M., Jung Younghun., Taichman Russell S., Pienta Kenneth J., Keller Evan T.(2019). Primary prostate cancer educates bone stroma through exosomal pyruvate kinase M2 to promote bone metastasis. J. Exp. Med., 216(12), 2883-2899. doi:10.1084/jem.20190158