靶向療法導致癌細胞耐藥性產(chǎn)生的根本原因！
摘要：
耐藥性的出現(xiàn)限制了靶向療法在人類腫瘤中的功效。普遍的看法是耐藥是既成事實：開始治療時，癌癥已經(jīng)含有耐藥性突變細胞。暴露于抗生素的細菌會暫時增加其突變率（自適應變異性），從而提高了生存的可能性。作者調(diào)查了人類結直腸癌（CRC）細胞是否同樣利用自適應變異性來規(guī)避治療壓力。作者發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（EGFR）/ BRAF抑制作用下調(diào)錯配修復（MMR）和同源重組（HR）DNA修復基因，并同時上調(diào)藥物耐受性（persister）細胞中易錯的聚合酶。在治療期間，源自患者的異種移植物和腫瘤標本中的MMR蛋白也下調(diào)。 EGFR / BRAF抑制可誘導DNA損傷，增加變異性并觸發(fā)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。因此，像單細胞生物一樣，腫瘤細胞通過增強變異性來規(guī)避治療壓力。
該文驗證了一種假說，即在治療過程中基因組不穩(wěn)定性的短暫增加也可能促進對靶向療法的耐藥性，從而導致從頭誘變。類似的過程，會增加對抗生素產(chǎn)生抗藥性的微生物菌株的出現(xiàn)。在穩(wěn)定的微環(huán)境中，微生物的突變率通常很低，從而避免了有害突變的積累。但是，已經(jīng)在細菌和酵母中描述了幾種由壓力引起的遺傳不穩(wěn)定性和增加的變異性的機制，稱為應激誘變（SIM）。通過降低生長速率，細菌持久性細胞可以在抗生素施加的致命應激條件下生存。
結果一、靶向治療引起的MMR下調(diào)細胞的HR和HR水平
作者研究了微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）人結腸直腸癌（CRC）細胞系對抗EGFR（表皮生長因子受體）抗體西妥昔單抗的反應，西妥昔單抗與panitumumab一起被批準用于治療腫瘤缺乏RAS和BRAF突變的轉(zhuǎn)移性CRC。接下來，作者評估了藥物治療后CRC細胞是否能調(diào)節(jié)DNA修復基因的表達。轉(zhuǎn)錄譜顯示，MMR基因MLH1，MSH2，MSH6以及同源重組（HR）效應子（如BRCA2和RAD51）的表達降低（圖1A）。 EXO1（一種編碼核酸外切酶的基因，參與失配和雙鏈斷裂（DSB）修復）的表達也受到了影響（圖1A）。還觀察到了MMR和HR蛋白的時間依賴性下調(diào)（圖1B）。在用靶向藥物處理過的CRC細胞中，MMR能力（MMRp）降低至與觀察到的水平相當在LIM1215中（圖1C）。接下來，作者通過使用基于質(zhì)粒的兩步法pDRGFP / pCBASce-I分析評估細胞的HR能力。在pDRGFP質(zhì)粒穩(wěn)定表達后，作者測量了由Sce-1表達誘導的DSB上綠色熒光信號的產(chǎn)生。通過這種測定，用靶向療法治療后，DiFi和WiDr細胞均顯示出HR能力的顯著降低（圖1D）。
圖1. CRC細胞調(diào)節(jié)DNA修復效應因子以響應靶向藥物
結果二、靶向治療后CRC殘留疾病樣本中的MMR蛋白下調(diào)
為了確定基于細胞的發(fā)現(xiàn)是否擴展到患者來源的腫瘤樣品，作者選擇了六個具有野生型KRAS，NRAS和BRAF的MSS PDX模型，其中西妥昔單抗抑制EGFR導致腫瘤消退的程度不同，與臨床情況平行（圖2A）。免疫組織化學分析顯示，當腫瘤處于對西妥昔單抗的最大反應點時，所獲得的所有腫瘤樣品中MLH1和/或MSH2的表達均下調(diào)，但仍含有殘留的持久性物質(zhì)與安慰劑治療的對照組相比（圖2B和C）。接下來，作者調(diào)查了兩名CRC患者的臨床標本中是否也發(fā)生了DNA修復蛋白的下調(diào)，這些患者在用FOLFOX加panitumumab治療后達到了客觀的部分應答。在這兩種情況下，當盡管治療仍存在有限數(shù)量的腫瘤細胞時，在診斷和最大治療反應時縱向收集腫瘤標本。與治療前的標本相比，在應答后獲得的腫瘤標本中的MLH1和MSH2下調(diào)，證實了作者研究結果的臨床意義（圖2D）。
圖2. CRC PDXs和靶向治療患者的MMR下調(diào)
結果三、在靶向治療后的CRC細胞中誘導DNA損傷和易錯DNA聚合酶
作者對DNA損傷的常見標記物Ser 139（γH2AX）處H2AX磷酸化的定量分析顯示，藥物治療后病灶陽性核的數(shù)量呈劑量和時間依賴性增加（圖3A-B）。這些數(shù)據(jù)表明靶向療法觸發(fā)了從高保真到易錯介導的DNA損傷修復的轉(zhuǎn)變，從而潛在地增加了賦予耐藥性的突變的發(fā)生。接下來，作者探討了靶向治療后觀察到的DNA損傷的可能原因。盡管幾種化學治療劑直接產(chǎn)生DNA損傷，但干擾致癌信號的藥物（例如EGFR或BRAF抑制劑）并非直接具有遺傳毒性。某些靶向療法會增加癌細胞中的活性氧水平，可能在治療過程中造成DNA損傷。當CRC細胞暴露于EGFR和BRAF抑制劑時，活性氧水平顯著增加（圖3C）。當在抗氧化劑N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）存在下進行靶向治療時，可以消除藥物引起的ROS水平升高（圖3C）。
結果四、干擾致癌依賴性可引發(fā)CRC的應激反應
在EGFR和BRAF藥理阻斷后，mTOR效應物pS6K-p70K被下調(diào)，其動力學與MMR和HR調(diào)節(jié)相當（圖3D）。但是，mTOR沉默不會影響DNA修復蛋白或γH2AX的表達（圖3E）。實際上，DiFi細胞中siRNA介導的EGFR或KRAS的敲低以及WiDr細胞中的BRAF（+/- EGFR）導致DNA修復蛋白表達降低，觸發(fā)了DNA損傷和mTOR下調(diào)（圖3E）。這些結果排除了藥物誘導的DNA修復途徑的下調(diào)可能是由于抗EGFR抗體西妥昔單抗或BRAF抑制劑dabrafenib的非特異性（脫靶）作用引起的。
圖3. 靶向治療可觸發(fā)應激反應，增加ROS水平，誘導CRC細胞DNA損傷
結果五、靶向療法可誘導CRC細胞適應性變異
二核苷酸CArepeat微衛(wèi)星驅(qū)動了NanoLuc酶編碼序列失讀（圖4A）。為了驗證測定，作者首先引入了CA-將NanoLuc載體導入MMRd人類CRC細胞系（HCT116）和三種MMRp人類CRC細胞系（DiFi，WiDr，NCIH508）。在標準生長條件下48小時后，MMRd細胞中的NanoLuc信號明顯更高（圖4B）。當將HCT116放置在培養(yǎng)物中數(shù)天時，這種差異進一步增加，而MMRp品系中的信號仍然很低（圖4B），這表明CA NanoLuc分析有效檢測了癌細胞中的MMR缺乏癥。MLH1 KO克隆表現(xiàn)出預期的更高水平的NanoLuc信號，證實了該測定法可以檢測DNA MMR的失活（圖4C）。接下來，評估了藥物依賴性（瞬態(tài)）MMR的下調(diào)。 EGFR和BRAF抑制導致生物發(fā)光的時間依賴性增加（圖4D），與DNA修復效應子的下調(diào)和低保真聚合酶的上調(diào)平行。
結果六、靶向療法可誘導CRC細胞適應性變異
作者使用了一種記者分析方法，其中二核苷酸CArepeat微衛(wèi)星驅(qū)動了NanoLuc酶編碼序列失讀（圖4A）。首先引入了CA-將NanoLuc載體導入MMRd人類CRC細胞系（HCT116）和三種MMRp人類CRC細胞系（DiFi，WiDr，NCIH508）。在標準生長條件下48小時后，MMRd細胞中的NanoLuc信號明顯更高（圖4B）。MLH1 KO克隆表現(xiàn)出預期的更高水平的NanoLuc信號，證實了該測定法可以檢測DNA MMR的失活（圖4C）。接下來，評估了藥物依賴性（瞬態(tài)）MMR的下調(diào)。EGFR和BRAF抑制導致生物發(fā)光的時間依賴性增加（圖4D），與DNA修復效應子的下調(diào)和低保真聚合酶的上調(diào)平行。
圖4. 靶向治療促進CRC細胞的誘變
結果七、靶向治療后CRC細胞的基因組改變
為了確定在使用EGFR和BRAF抑制劑處理的CRC細胞的基因組中是否存在適應性變異的分子證據(jù)，作者分析了DiFi和WiDr親代，持久性和耐藥性衍生細胞的全外顯子測序（WES）數(shù)據(jù)。作者還檢測到了對靶標藥物具有抗性的CRC細胞微衛(wèi)星區(qū)域的遺傳不穩(wěn)定性增加（圖5A和B），突出了靶向治療對DNA的影響修復過程和致突變性。為了檢測非克隆細胞群體中微衛(wèi)星變化的發(fā)生，作者利用了一個高深度捕獲板高靈敏度的分析揭示了持久性和耐藥性細胞中微衛(wèi)星區(qū)域長度的顯著變化（圖5C）。對西妥昔單抗耐藥的腫瘤組織的WES分析顯示，微衛(wèi)星基因組區(qū)域發(fā)生了變化，而從相應的未治療小鼠收集的PDX腫瘤中卻不存在這種變化（圖5D和E）。總體而言，暴露于靶向療法的CRC細胞和CRC PDX在核苷酸重復區(qū)域中經(jīng)歷了復制保真度的損失。
圖5. 適應性突變導致CRC細胞在治療誘導的應激反應中的遺傳不穩(wěn)定性
結論:
EGFR / BRAF抑制可誘導DNA損傷，增加變異性并觸發(fā)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。因此，像單細胞生物一樣，腫瘤細胞通過增強變異性來規(guī)避治療壓力?？梢圆捎盟幚韺W或遺傳學上的抑制作用來抑制啟動藥物驅(qū)動的適應性誘變的細胞機制，以減少治療過程中新變異的產(chǎn)生。這種策略可能會增加和延長靶向療法的臨床療效。