鐵死亡與胃癌的獲得性耐藥有什么關(guān)聯(lián)？

    Ferroptosis是一種調(diào)節(jié)細胞死亡的新形式，涉及鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物（脂質(zhì)-ROS）的積累，并導(dǎo)致細胞的致死性損害。然而，成纖維細胞（CAF）在調(diào)節(jié)脂類代謝以及癌細胞的鐵死亡中的作用仍未被探索，并且仍然是謎。本研究采用質(zhì)譜法篩選胃癌中與鐵死亡相關(guān)的基因。通過超速離心分離外泌體，并通過RT-qPCR確定成纖維細胞（CAF）分泌的miRNA。使用Elastin誘導(dǎo)鐵死亡，并通過測量脂質(zhì)ROS，細胞活力和線粒體膜電位來評估鐵死亡水平。更重要的是，順鉑和紫杉醇通過激活USP7 / hnRNPA1軸來促進成纖維細胞（CAF）分泌miR-522，從而導(dǎo)致ALOX15抑制并減少脂質(zhì)-ROS在癌細胞中的蓄積，并最終導(dǎo)致化學(xué)敏感性降低。

結(jié)果一、GC中與鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因的篩選
    經(jīng)過質(zhì)譜比較GC特異性蛋白，與癌旁組織（P）相比，一組蛋白在GC腫瘤組織（T）中明顯失調(diào)。 ALOX15是導(dǎo)致ferroptosis的關(guān)鍵基因之一，其表達量急劇下降，而腫瘤組織中USP7和hnRNPA1的水平明顯升高。 然后，通過IHC分析檢查了ALOX15的分布，并且ALOX15主要在癌旁組織的腺細胞中表達，并在腺瘤細胞中少量表達。而且，高水平的ALOX15蛋白還與胃癌患者更好的總體生存率（OS）相關(guān)，表明ALOX15在GC中起抗癌作用。這些數(shù)據(jù)表明，ALOX15在介導(dǎo)胃腫瘤中脂質(zhì)-ROS產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用。

結(jié)果二、外泌體miR-522主要來源于腫瘤微環(huán)境中的CAF
    與NFs相比，CAFs中所有CAFs，α-SMA，F(xiàn)AP和FSP1的標(biāo)記均明顯增加（。與腫瘤細胞和NFs相比，在CAF中發(fā)現(xiàn)了最高的miR-522濃度。在CAF外泌體中，miR-522的水平最高，其次是TC外泌體，而在三種外泌體中，CAF外泌體中miR-522的含量絕對占主導(dǎo)地位。源自CAF的外泌體miR-522也與ALOX15和Lipid-ROS呈負相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，GC腫瘤微環(huán)境中的exo-miR-522主要由CAF分泌。

結(jié)果三、CAF分泌exo-miR-522抑制GC細胞的肥大化
    為了測試源自CAF的exo-miR-522在調(diào)節(jié)癌細胞的鐵死亡中的功能，分離了CAF外泌體并與人胃癌細胞系共培養(yǎng)。 CAF中miR-522的量是GC細胞系的6倍，并且在外泌體中觀察到了相同的趨勢。將CAF外泌體與GC細胞共培養(yǎng)，并在6h時在SGC7901細胞和MKN45細胞中均檢測到PKH-26標(biāo)記的CAF外泌體，這表明源自CAF的外泌體可以與GC細胞有效融合。 CAF外泌體可顯著抑制GC細胞中ALOX15的表達，而不會影響依賴miR-522的ALOX15 mRNA的含量。此外，用抑素處理的SGC7901細胞顯示出明顯的線粒體膜電位（MMP）升高，CAF外泌體部分逆轉(zhuǎn)了抑素對線粒體的損傷。總而言之，CAF分泌的exo-miR-522抑制了ALOX15的表達并下調(diào)了GC細胞中鐵死亡的水平。

結(jié)果四、USP7通過穩(wěn)定hnRNPA1促進miR-522分泌
    據(jù)報道，hnRNP家族是將一系列mRNA和非編碼RNA包裝到外泌體中所必需的。在與成對的NF相比，hnRNPA1和USP7在CAF中高表達。此外，hnRNPA1和USP7的水平均與外泌體miR-522正相關(guān)，這表明USP7和hnRNPA1參與了CAFs的miR-522分泌。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了hnRNPA1和USP7的表達，而siRNA的應(yīng)用導(dǎo)致這兩個基因的急劇減少。 hnRNPA1或USP7在CAFs中的過表達促進了miR-522向外泌體的包裝。救援實驗表明，過表達的hnRNPA1或USP7部分抵消了各自siRNA對exo-miR-522的作用。接下來，可以通過使用抗hnRNPA1抗體在免疫沉淀測定的產(chǎn)物中檢測到USP7。此外，USP7還顯示與hnRNA1泛素化水平呈負相關(guān)?？傮w而言， USP7通過去泛素化作用使CAF中的hnRNPA1穩(wěn)定下來，導(dǎo)致外泌體miR-522的分泌增加。

結(jié)果五、hnRNPA1直接介導(dǎo)miR-522包裝到CAF衍生的外泌體中
   為了進一步驗證hnRNPA1在將miR-522選擇性包裝入外泌體中的作用，使用RBPDB（RBP特異性數(shù)據(jù)庫，http：//rbpdb.ccbr.utoronto.ca/）預(yù)測了潛在的miR-522結(jié)合蛋白。結(jié)果表明hnRNPA1在介導(dǎo)miR-522到CAF外泌體的包裝中起著至關(guān)重要的作用。

結(jié)果六、化學(xué)毒性通過激活USP7 / hnRNPA1途徑促進CAF分泌miR-522
    為了獲得CAF中由化學(xué)療法引起的損傷反應(yīng)，作者檢查了用亞致死劑量的順鉑或紫杉醇處理過的GC細胞。體外實驗證明CAF外泌體有助于降低化療期間的藥物敏感性。

結(jié)果七、USP7 / hnRNPA1 / miR-522在調(diào)節(jié)胃腫瘤生長和化學(xué)敏感性中的體內(nèi)作用
    在體內(nèi)評估了USP7 / hnRNPA1 / miR-522軸在影響腫瘤生長和化學(xué)治療功效中的作用。結(jié)果表明USP7 / hnRNPA1促進CAF分泌exo-miR-522，降低腫瘤中的脂質(zhì)ROS水平并促進腫瘤生長。此外，這些數(shù)據(jù)還表明，可以通過阻斷miR-522的分泌來改善化療藥物的作用。

結(jié)果八、USP7 / hnRNPA1 / exo-miR-522途徑對腫瘤植入小鼠存活的影響
    USP7，hnRNPA1和miR-522的表達受抑制延長了荷瘤小鼠的生存期，順鉑組的小鼠比用鹽水治療的小鼠具有更好的生存期。 最后，作者提供了一個示意圖來顯示包括USP7，hnRNPA1，exo-miR-522和ALOX15在內(nèi)的跨細胞信號通路在調(diào)節(jié)GC細胞的肥大作用中的生物學(xué)作用。

結(jié)論：
    該研究闡明了TME衍生的外來體通過轉(zhuǎn)運特殊的信號傳遞信息在調(diào)節(jié)癌細胞的鐵死亡中的新作用。 這項研究還提供了一種新的想法，即通過阻止特定的miRNA包裝到外泌體中來觸發(fā)腫瘤中的細胞死亡。