自噬與血管重塑

    跨膜成員16A（TMEM16A）是鈣激活的氯離子通道的一個(gè)組成部分，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞（SMC）的增殖和重塑。自噬是真核生物中高度保守的細(xì)胞分解代謝過程，在血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)揮著重要的生理功能。TMEM16A是否參與自噬介導(dǎo)的血管重塑尚不清楚。接下來小編為大家?guī)戆l(fā)表于“Theranostics”上的文章“TMEM16A ameliorates vascular remodeling by suppressing autophagy via inhibiting Bcl-2–p62 complex formation”。在本研究中，我們研究了自噬對(duì)血管內(nèi)SMC的增殖和重構(gòu)的貢獻(xiàn)，并研究了TMEM16A是否參與了這些過程。

結(jié) 果：
1.自噬水平與血管重塑呈正相關(guān)
    為探討自噬是否參與血管性高血壓誘導(dǎo)的血管重塑，測(cè)定了自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，從術(shù)后1周開始，AngII誘導(dǎo)的高血壓小鼠主動(dòng)脈中LC3B-II的表達(dá)逐漸增加（圖1A）。此外，AngII灌注顯示主動(dòng)脈平滑肌中LC3B陽性綠點(diǎn)的數(shù)量隨時(shí)間而增加，如平滑肌標(biāo)記物α-SMA（圖1B和C）。盡管AngII引起的血管壁和管腔直徑的減小是輕微的，但與相應(yīng)的假手術(shù)組相比，差異是顯著的（圖1D和E）。因此，從術(shù)后1周開始，AngII灌注逐漸增加了中膜厚度和平均內(nèi)側(cè)CSA值（圖1F和G）。值得注意的是，相關(guān)分析表明，LC3B點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)與血管性高血壓時(shí)胸主動(dòng)脈內(nèi)側(cè)CSA值呈正相關(guān)（圖1H），表明自噬可能在血管重塑中發(fā)揮作用。

2.TMEM16A抑制大動(dòng)脈血管中AngII誘導(dǎo)的自噬
    與假手術(shù)小鼠相比，從術(shù)后2周開始，AngII高血壓小鼠的主動(dòng)脈中TMEM16A的表達(dá)逐漸減少（圖2A）。有趣的是，TMEM16A表達(dá)的降低與AngII高血壓小鼠主動(dòng)脈中LC3B陽性點(diǎn)狀數(shù)目呈負(fù)相關(guān)（圖2B）。為探討TMEM16A在高血壓大鼠主動(dòng)脈血管自噬中的作用，制備了TMEM16A-SMC特異性轉(zhuǎn)基因小鼠（TMSMC-Tg），并注入AngII。如圖2C所示，假手術(shù)TMcon和TMSMC-Tg小鼠主動(dòng)脈中LC3B-II、Beclin-1和p62的表達(dá)差異不顯著。然而，與TMcon小鼠相比，TMSMC-Tg小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)LC3B-II和Beclin-1表達(dá)的增加以及p62表達(dá)的減少均受到明顯抑制。免疫熒光染色顯示，SMC特異性TMEM16A的過度表達(dá)顯著減弱了AngII誘導(dǎo)的增加的LC3B陽性點(diǎn)狀細(xì)胞（圖2D）。進(jìn)一步的電鏡觀察顯示，與假手術(shù)小鼠相比，AngII處理小鼠的胸主動(dòng)脈中層自噬體增多。TMEM16A上調(diào)顯著抑制自噬體的積累（圖2E）。這些數(shù)據(jù)提示TMEM16A的表達(dá)在調(diào)節(jié)血管自噬中起重要作用。

3.TMEM16A阻斷AngII誘導(dǎo)的自噬通量
    我們的研究結(jié)果顯示，抑制TMSMC-Tg小鼠的AngII誘導(dǎo)的自噬，有助于我們研究TMEM16A在體外是否發(fā)揮類似的作用。結(jié)果表明，TMEM16A過表達(dá)顯著抑制了AngII誘導(dǎo)的LC3B-II和Beclin-1表達(dá)的增加以及p62表達(dá)的減少（圖3A）。為了區(qū)分LC3B-II和Beclin-1水平的升高是由于自噬體形成增加還是自噬體-溶酶體融合受損，我們研究了氯喹（溶酶體抑制劑）對(duì)LC3B-II表達(dá)的影響。結(jié)果表明，在抑制溶酶體活性后，經(jīng)AngII處理的MASMCs中LC3B-II的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。然而，TMEM16A過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了氯喹對(duì)LC3B-II表達(dá)的影響，提示TMEM16A抑制了自噬小體的形成（圖3B）。為了證實(shí)TMEM16A對(duì)自噬通量的影響，我們采用串聯(lián)的mRFP-GFP-LC3腺病毒進(jìn)行熒光分析。與mRFP相比，GFP熒光在較高pH值下是最佳的，并且在溶酶體酸性環(huán)境中可以更快地猝滅，這使得我們能夠通過分別檢測(cè)黃點(diǎn)（GFP+/mRFP+）和紅點(diǎn)（GFP-/mRFP+）來監(jiān)測(cè)自噬體和自溶體。經(jīng)AngII處理的MASMCs可見豐富的黃色和紅色斑點(diǎn)。然而，異位過表達(dá)TMEM16A與單獨(dú)使用AngII治療相比，顯著減少了黃點(diǎn)和紅點(diǎn)的數(shù)量（圖3C-E），表明TMEM16A通過抑制自噬通量來減弱AngII誘導(dǎo)的自噬。

4.下調(diào)TMEM16A促進(jìn)AngII誘導(dǎo)的自噬通量
    為了進(jìn)一步闡明TMEM16A在自噬調(diào)節(jié)中的作用，我們用siRNA敲除了TMEM16A在MASMCs中的表達(dá)。結(jié)果表明，TMEM16A基因敲除進(jìn)一步增強(qiáng)了AngII誘導(dǎo)的LC3B-II和Beclin-1表達(dá)增加和p62表達(dá)減少（圖4A）。此外，氯喹對(duì)經(jīng)TMEM16A siRNA處理的細(xì)胞LC3B-II表達(dá)的影響增強(qiáng)（圖4B），表明TMEM16A下調(diào)進(jìn)一步促進(jìn)自噬體成熟。與單用AngII處理相比，TMEM16A基因敲除顯著增加了黃點(diǎn)和紅點(diǎn)的數(shù)量（圖4C-E），表明TMEM16A基因敲除增強(qiáng)了AngII誘導(dǎo)的自噬。

5.TMEM16A抑制AngII誘導(dǎo)的VPS34活性
    為了確定TMEM16A調(diào)節(jié)自噬的機(jī)制，我們研究了TMEM16A對(duì)mTOR途徑的影響。出乎意料的是，與假手術(shù)小鼠相比，經(jīng)AngII處理的小鼠主動(dòng)脈中AKT、mTOR和下游靶點(diǎn)p70S6K的磷酸化顯著增加，而4-EBP1磷酸化被抑制。相反，SMC特異性TMEM16A過表達(dá)顯著抑制了mTOR途徑的激活（圖5A和B）。此外，AngII誘導(dǎo)的高血壓TMSMC-Tg和TMcon小鼠主動(dòng)脈中VPS34的表達(dá)相似（圖5C）。AngII素輸入顯著增加了VPS34的激酶活性，而VPS34被SMC特異性TMEM16A過表達(dá)所抑制（圖5D）。
    考慮到TMEM16A和自噬在血管重塑中的作用，以及TMEM16A調(diào)節(jié)自噬的能力，我們探討了自噬在TMEM16A介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和重塑中的作用。結(jié)果表明，在基礎(chǔ)條件下，TMcon和TMSMC-Tg小鼠胸主動(dòng)脈Ki67陽性細(xì)胞數(shù)和中間CSA值相似。然而，AngII注射顯著增加了TMcon小鼠Ki67染色水平和CSA中間值，而這在TMSMC-Tg小鼠中受到抑制。此外，3-MA，一種靶向VPS34的自噬抑制劑，顯著抑制AngII誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管重塑（圖5E和F）。值得注意的是，雷帕霉素，一種通過抑制mTOR信號(hào)傳導(dǎo)的自噬刺激劑，并沒有逆轉(zhuǎn)TMEM16A上調(diào)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管重塑的抑制作用，而是增強(qiáng)了這種作用（圖5E和F）。此外，AngII誘導(dǎo)的MASMC增殖被TMEM16A過表達(dá)顯著減弱，并被TMEM16A敲除增強(qiáng)（圖5G和H）。VPS34的過表達(dá)消除了TMEM16A上調(diào)對(duì)AngII誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用（圖5G）。此外，用更高選擇性抑制劑（SAR405）對(duì)VPS34的藥理學(xué)抑制很大程度上消除了TMEM16A下調(diào)引起的細(xì)胞增殖增加（圖5H）?？傊?，這些結(jié)果表明，抑制VPS34介導(dǎo)的自噬是TMEM16A對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和重塑作用的基礎(chǔ)。

6.TMEM16A從p62/Bcl-2/Beclin-1/VPS43復(fù)合物中分離p62并抑制自噬的發(fā)生
    為了研究TMEM16A如何減弱VPS34的活性和隨后的自噬通量，我們研究了TMEM16A在調(diào)節(jié)自噬起始中的作用。結(jié)果表明，TMEM16A與p62共免疫沉淀（圖6A和B）。在轉(zhuǎn)染HA-RFP-TMEM16A和His-p62的細(xì)胞中，TMEM16A始終與外源p62相互作用（圖6C和D）。以前有報(bào)道稱p62結(jié)合Bcl-2并阻止Bcl-2/Beclin-1復(fù)合物的形成。Bcl-2-Beclin-1相互作用的中斷促進(jìn)了Beclin-1-VPS34的關(guān)聯(lián)，并增加了Beclin-1相關(guān)的VPS34活性?；诖?，我們接下來檢查這些相關(guān)蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)。用AngII處理的MASMCs分別增加了p62-Bcl-2和VPS34-Beclin-1的結(jié)合，但減少了與Beclin-1共免疫沉淀的Bcl-2的數(shù)量（圖6E-H）。TMEM16A過表達(dá)顯著限制了p62-Bcl-2和VPS34-Beclin-1的形成，但逆轉(zhuǎn)了Bcl-2-Beclin-1結(jié)合的減少（圖6E和F）。相反，TMEM16A的抑制增強(qiáng)了p62-Bcl-2和VPS34-Beclin-1的結(jié)合，進(jìn)一步破壞了Bcl-2-Beclin-1復(fù)合物的形成（圖6G和H）。這表明TMEM16A至少部分地通過p62、Bcl-2、Beclin-1和VPS34之間的四向相互作用來調(diào)節(jié)VPS34的活性。

結(jié) 論：
    總之，TMEM16A通過調(diào)節(jié)p62、Bcl-2、Beclin-1和VPS34之間的四向相互作用抑制自噬介導(dǎo)的VSMC增殖，降低VPS34的活性，從而改善血管重塑。這些發(fā)現(xiàn)為TMEM16A減輕血管重塑的機(jī)制提供了新的見解，并為該病的靶向治療提供了新的思路。