自噬相關蛋白PIK3C3/VPS34控制T細胞代謝和功能
Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）復合物的PIK3C3/VPS34亞基是大自噬/自噬的早期關鍵因子。在這項研究中，我們評估了PIK3C3對T細胞代謝和功能的貢獻。這篇文章發(fā)表于“Autophagy”，題目為“Autophagy-related protein PIK3C3/VPS34 controls T cell metabolism and function”。
在這篇研究中，我們發(fā)現Pik3c3-31缺陷型T細胞表現出細胞代謝受損，Pik3c3缺陷型CD4+T 細胞未能分化為T輔助細胞。這些改變與T細胞活化時活性線粒體減少水平有關。此外，有條件的Pik3c3缺陷動物未能產生自身反應性T細胞反應，對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）有抵抗力。有趣的是，Pik3c3的缺失對動物清除腫瘤轉移的能力幾乎沒有影響。
結 果：
1.Pik3c3基因在T細胞中的缺失重組基因表達
為了更好地了解Pik3c3缺失對T細胞功能的潛在影響，我們產生了Pik3c3f/f，Cd4-Cre小鼠，其在T細胞中表現出選擇性的Pik3c3消融。我們研究了來自Pik3c3f/f 和pik3c3f/f，Cd4-Cre小鼠的富含FACS的CD4+和CD8A+T細胞的轉錄組。RNA測序分析顯示，轉錄水平在全基因組范圍內發(fā)生了顯著變化。CD4+T細胞中Pik3c3缺乏顯著誘導或降低基因表達，包括Pik3c3（圖1A）。隨后的途徑富集分析確定了Pik3c3缺陷CD4+T細胞中受影響有糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、N-聚糖生物合成和cAMP信號途徑（圖1B）。CD8A+T細胞中Pik3c3缺陷也誘導或減少基因表達，包括Pik3c3（圖1C）。然而，富集分析沒有顯示任何細胞代謝改變的證據（圖1D）。相反，受影響最顯著的途徑與唾液分泌、MAPK 信號途徑和麻疹相關（圖1D）。許多細胞代謝相關基因在CD4+T中被調控超過10倍（圖1E）。我們還觀察到Pik3c3缺陷性CD4+T細胞中Th1細胞特異性轉錄因子Tbx21的表達降低（圖1E）。相比之下，其他Th細胞轉錄因子如Gata3、Rorc和Foxp3的表達沒有顯著差異（圖1E）。
2.Pik3c3缺失引起活化T細胞線粒體功能和代謝的改變
我們之前已經證明pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠的外周T細胞丟失是由于細胞器的積累和穩(wěn)態(tài)時細胞凋亡的增加。因此，我們進一步研究了PIK3C3在T細胞克隆擴增過程中對T細胞存活的作用。我們用抗CD3E和抗CD28抗體對Pik3c3f/f和pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠的脾細胞進行了刺激，并用流式細胞儀測定了刺激后活細胞的百分比。Pik3c3缺失T細胞的百分比明顯低于富含Pik3c3 的T細胞，后者增殖緩慢（圖2A和2B）。由于自噬是維持激活后ATP產生的必要條件，我們接下來評估了自噬失敗對T細胞代謝的影響。我們用細胞外流量分析儀測量了活化T細胞的耗氧率（OCR）和細胞外酸化率（ECAR）的變化，分析了活化T細胞的線粒體呼吸和有氧糖酵解。Pik3c3缺乏顯著降低活化的CD4+和CD8A+T 細胞的OCR和ECAR（圖2C、2D）。這一結果證實了RNA序列數據，即與糖酵解和氧化磷酸化相關的基因被下調（圖1E）。有趣的是，與CD8A+T細胞相比，CD4+T細胞OCR和ECAR的降低更為顯著。
為探討Pik3c3f/f和 pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠T細胞代謝的不同機制，我們評估了T細胞系的線粒體質量和功能。與對照T細胞相比，缺乏Pik3c3的CD4+和CD8A+T細胞的基礎Mitoview（線粒體膜染色）染色增強，表明缺乏Pik3c3時線粒體有積累（圖2E和2F）。在Pik3c3f/f和pik3c3f/f；CD4-Cre小鼠中，CD4+或CD8A+T細胞的激活導致了有絲分裂染色的顯著增加（圖2E和2F）。然而，與Pik3c3缺陷的CD4+T細胞相比，Mitoview染色在Pik3c3足夠的CD4+T細胞中的增加更為顯著。我們假設，Pik3c3缺陷T細胞代謝減少可能是由于線粒體狀態(tài)的改變和線粒體負荷。為了測試這一點，我們用四甲基羅丹明乙酯高氯酸鹽（TMRE）對細胞進行染色，發(fā)現與Pik3c3f/f；Cd4 Cre小鼠相比，刺激導致Pik3c3f/f小鼠的CD4+和CD8A+T細胞線粒體膜電位升高（圖2E和2F）。CD4+T細胞活化誘導TMRE的增加比CD8A+T細胞的高。總的來說，這些結果表明PIK3C3在T細胞活化過程中維持健康的線粒體負荷增加需要，特別是在CD4+T細胞中。
3.T細胞Pik3c3缺失抑制Th1細胞分化
先前的研究表明，自噬在不同的T輔助亞群中受到不同的調節(jié)。因此，我們接下來評估Pik3c3缺乏是否調節(jié)T輔助細胞分化。我們在Th1、Th2、Th17和Treg偏斜條件下培養(yǎng)MACS分選的Pik3c3足夠和缺失的CD4+SELL/CD62L+T細胞，然后用抗CD3E抗體重新激活細胞，以評估每個亞群的標志性細胞因子或轉錄因子的表達。我們發(fā)現在這些不同極化條件下培養(yǎng)的原始CD4+T細胞在Pik3c3缺失時對細胞死亡有不同的敏感性。Pik3c3缺乏的T細胞在Th1下，Th2和Treg條件下培養(yǎng)更加敏感，而在Th17細胞培養(yǎng)條件下對細胞死亡敏感性相對較低（圖3 A和B）。在Th1細胞條件下，在缺乏Pik3c3的情況下，產生IFNG細胞的比例顯著降低（圖3C和3D）。然而，在Th2條件下培養(yǎng)的細胞中， IL4的表達沒有差異，IL17A在Th17條件下培養(yǎng)的細胞中表達沒有差異，FOXP3在Treg條件下培養(yǎng)的細胞中表達沒有差異，（圖3C和3D）。這些數據證實了我們的RNA序列研究中轉錄變化的無偏測量，表明減少了Tbx21的表達，但在缺乏CD4+T細胞中Gata3、Rorc和Foxp3的表達沒有差異（圖1E）。
4.T細胞Pik3c3缺乏導致對EAE誘導的抵抗
我們推測Pik3c3缺失抑制自身免疫反應的發(fā)展。我們使用多發(fā)性硬化的EAE模型來測試T細胞中Pik3c3缺失是否導致EAE誘導的抵抗。結果表明，pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠對EAE完全耐藥，而在同一實驗中，所有pik3c3f/f小鼠均出現EAE征象（圖4A）。我們認為pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠對EAE誘導的抗性增加可能與T細胞啟動減少有關。因此，我們評估了抗原特異性T細胞反應，發(fā)現在pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠中，MOG 211（髓鞘少突膠質細胞糖蛋白）特異性IFNG+CD4+T細胞顯著減少（圖4B）。IL17+CD4+T細胞也適度減少，盡管沒有統(tǒng)計學差異（圖4B）。另外，我們發(fā)現所有的rubcn-/-小鼠都出現了EAE癥狀，與WT對照小鼠相似（圖4C）。這些結果表明pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠對EAE誘導的保護作用最有可能不是由有缺陷的非規(guī)范自噬引起的。
為了更好地確定EAE對T細胞Pik3c3缺乏的抗性，我們用Rosa26-CreERT2小鼠培育Pik3c3f/f小鼠，產生Pik3c3f/f；Rosa26-CreERT2小鼠。從MOG35-55免疫動物獲得的4-OH三苯氧胺處理的ER-Cre+細胞過繼轉移到同源WT（PTPRCa/CD45.1）動物，導致對EAE發(fā)育的保護，而在同一個實驗中，接受載體處理的ER-Cre+細胞的動物出現EAE跡象（圖4D）。我們隨后測定了小鼠中樞神經系統(tǒng)浸潤白細胞的頻率。接受4-OH三苯氧胺處理的ER-Cre+細胞的小鼠的中樞神經系統(tǒng)浸潤PTPRCb/CD45.2+細胞和CD4+T細胞的比例明顯低于接受載體處理的ER-Cre+細胞的小鼠（圖4E和4F）?？傊?，這些數據表明，PIK3C3在自身免疫反應的誘導和效應階段都具有關鍵作用。
5.未改變的腫瘤轉移易感性
為了確定Pik3c3在腫瘤轉移中的重要性，我們用靜脈注射Lewis肺癌（LLC）細胞或B16黑色素瘤細胞對Pik3c3f/f和pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠進行了檢測，并監(jiān)測了肺腫瘤的定植情況。有趣的是，與Pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠相比，Pik3c3f/f小鼠具有相似的LLC和B16黑色素瘤腫瘤負荷（圖5A-C）。為了更好地理解潛在的機制，我們分析了腫瘤定植肺中的免疫細胞群。我們在Pik3c3f/f和Pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠的肺中發(fā)現了相似的細胞總數。腫瘤的免疫組織學分析證實pik3c3f/f；CD4-Cre小鼠CD4+T細胞和CD8A+T細胞的頻率降低（圖5D）。流式細胞術分析顯示， pik3c3f/f；CD4-Cre小鼠CD4+T細胞、CD8A+T細胞和Tregs、未改變的B細胞和MDSCs的頻率顯著降低，而KLRB1C/NK1.1+細胞增加（圖5E和5F）。CD8A+T細胞表型分析顯示pik3c3f/f；Cd4-Cre 255小鼠的效應細胞CD44+SELL-T細胞頻率增加（圖5G）。然而，Pik3c3缺乏并沒有改變PTPRC/CD45+257細胞對LLC腫瘤細胞的抗腫瘤細胞溶解功能（圖5H和5I）?？偟膩碚f，結果表明，T細胞中Pik3c3的缺失對效應細胞清除腫瘤轉移的功能影響有限。
結 論：
總之，我們的數據揭示了PIK3C3在T細胞代謝和功能中的關鍵作用。T細胞中的PIK3C3在EAE過程中也可能通過典型的自噬依賴途徑參與這些細胞的致病性。因此，我們的研究對通過靶向PIK3C3治療多發(fā)性硬化和其他自身免疫性疾病的有效免疫療法的發(fā)展具有意義。