鐵死亡(Ferroptosis)是一種調(diào)控細(xì)胞死亡的新形式,涉及鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物(脂質(zhì)-ROS)的積累,并導(dǎo)致細(xì)胞致命性損害。最近的研究已經(jīng)確定鐵死亡在介導(dǎo)腫瘤的發(fā)展和耐藥性在某些類型的癌癥中的重要作用,但其具體分子機制仍然知之甚少。今年2月,來自天津醫(yī)科大學(xué)的研究團隊在Molecular Cancer上發(fā)表了一篇題名為:CAF secreted miR-522 suppresses ferroptosis and promotes acquired chemo-resistance in gastric cancer的文章。該文章主要講述了CAF通過靶向ALOX15并阻斷脂質(zhì)ROS的積累,分泌外泌體miR-522來抑制癌細(xì)胞的鐵死亡。包括USP7,hnRNPA1,exo-miR-522和ALOX15在內(nèi)的細(xì)胞間途徑揭示了胃癌(GC)獲得化療耐藥性的新機制。
結(jié) 果:
1.GC中與鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因的篩選
首先使用質(zhì)譜比較GC特異性蛋白,與癌旁組織(P)相比,一組蛋白在GC腫瘤組織(T)中明顯失調(diào)。 ALOX15是導(dǎo)致ferroptosis的關(guān)鍵基因之一,顯示出急劇下降,而腫瘤組織中USP7和hnRNPA1的水平明顯升高。隨后,在12例胃癌患者中通過WB和RT-qPCR分析測量ALOX15蛋白和mRNA表達ALXO15蛋白總體呈下降趨勢,但ALOX15 mRNA沒有明顯變化。因此,ALOX15主要在轉(zhuǎn)錄后水平受GC細(xì)胞的調(diào)節(jié)。通過IHC分析檢查了ALOX15的分布,并且ALOX15主要在癌旁組織的腺細(xì)胞中表達,并在腺瘤細(xì)胞中少量表達。根據(jù)ALOX15蛋白水平的平均值,將GC患者分為ALOX15高組(n = 77)和ALOX15低組(n = 86)。 高水平的ALOX15蛋白還與胃癌患者更好的總體生存率(OS)相關(guān),這表明ALOX15可以作為GC中的一種抗癌因子。由于脂質(zhì)ROS是ALOX15產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物,因此,腫瘤組織中的脂質(zhì)ROS水平明顯降低(圖與ALOX15正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明,ALOX15在介導(dǎo)胃腫瘤中脂質(zhì)-ROS產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用。
2.外泌體miR-522可作為ALOX15的潛在上游調(diào)節(jié)劑
通過超速離心分離正常受試者和GC患者的血清外泌體,經(jīng)鑒定具有外泌體特征。由于在ALOX15蛋白和ALOX15 mRNA之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性,推斷ALOX15在轉(zhuǎn)錄后水平受miRNA調(diào)控。預(yù)測miR-522與ALOX15 mRNA相互作用。據(jù)報道,miR-522促進非小細(xì)胞肺癌,結(jié)腸直腸癌和肝細(xì)胞癌的腫瘤進展,但尚未明確miR-522在胃癌中的作用。我們的數(shù)據(jù)顯示,GC患者的血清外泌體和腫瘤組織中的miR-522均上調(diào),并且exo-miR-522與腫瘤等級呈正相關(guān)。 此外,發(fā)現(xiàn)miR-522與ALOX5表達以及脂質(zhì)ROS負(fù)相關(guān)。根據(jù)miR-522的平均值,將GC患者分為miR-522高組(n = 184)和miR-522低組(n = 162)。生存曲線是從在線數(shù)據(jù)庫生成的,并且高水平的miR-522預(yù)測GC的存活率很差。 因此,這些結(jié)果表明miR-522,ALOX15和脂質(zhì)-ROS積累之間潛在的臨床相關(guān)性。
3.外泌體miR-522主要來源于腫瘤微環(huán)境中的CAF
盡管證明外泌體miR-522在GC中明顯上調(diào),但miR-522的起源仍不清楚。分離腫瘤組織中的CAFs和癌旁組織中的正常成纖維細(xì)胞(NFs),并在原代細(xì)胞和外泌體中測量miR-522的水平。CAF中的標(biāo)記α-SMA,F(xiàn)AP和FSP1表達量明顯高于NF。GC細(xì)胞的標(biāo)志物CEA和CK-18在NF和CAF中不表達,腫瘤細(xì)胞不表達α-SMA,F(xiàn)AP和FSP1。CAF 在三種細(xì)胞中miR-522表達最高,提取外泌體并鑒定,CAF外泌體中miR-522的含量在這三種外泌體中占主導(dǎo)地位。不出所料,源自CAF的外泌體miR-522也顯示與ALOX15和脂質(zhì)ROS呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明,GC腫瘤微環(huán)境中的exo-miR-522主要由CAF分泌。
4.CAF分泌exo-miR-522抑制GC細(xì)胞的鐵死亡
為了測試源自CAF的exo-miR-522在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的肥大性中的功能,分離了CAF外泌體并與人胃癌細(xì)胞系共培養(yǎng)。CAF中miR-522的量是GC細(xì)胞系的6倍,外泌體中也觀察到了相同的趨勢。將CAF外泌體與GC細(xì)胞共培養(yǎng),并在6 h時在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中均檢測到PKH-26標(biāo)記的CAF外泌體,表明CAF衍生的外泌體可以與GC細(xì)胞有效融合。CAF外泌體miR-522可顯著抑制GC細(xì)胞中ALOX15的表達,而不會影響ALOX15 mRNA的含量。此外,已證明exo-miR-522可有效抑制GC細(xì)胞中蛋白激酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)ROS積累和鐵死亡。 經(jīng)過Eaststin處理的SGC7901細(xì)胞顯示出明顯的線粒體膜電位(MMP)升高,并且CAF外泌體部分逆轉(zhuǎn)了Eaststin對線粒體的損傷??偠灾?,CAF分泌的exo-miR-522抑制了ALOX15的表達并下調(diào)了GC細(xì)胞中鐵死亡的水平。
5.驗證miR-522與ALOX15之間的直接相互作用
預(yù)測將三種miRNA,miR-522,miR-106a和miR-125b作為ALOX15的上游調(diào)節(jié)子,但是,miR-106a和miR-125b在CAF和NF之間顯示出很小的差異。因此,選擇了miR-522作為ALOX15的潛在調(diào)節(jié)劑。隨后,進行熒光素酶報告基因檢測,進一步揭示了miR-522和ALOX15 mRNA的直接接觸。構(gòu)建了含有miR-522結(jié)合區(qū)的熒光素酶報告質(zhì)粒,并將含有miR-522結(jié)合位點(mut)的反向序列的質(zhì)粒用作陰性對照。miR-522模擬物的轉(zhuǎn)染或CAF外泌體的治療會導(dǎo)致螢光素酶活性的顯著抑制。而敲除miR-522則相對增加了螢光素酶的水平。過表達的miR-522顯著降低了ALOX15的水平,而轉(zhuǎn)染miR-522抑制劑促進了SGC7901和MKN45細(xì)胞中ALOX15的表達。但是在miR-522處理下ALOX15的mRNA幾乎沒有變化,這表明miR-522在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控ALOX15的表達。在SGC7901細(xì)胞中使用生物素標(biāo)記的miR-522進行免疫沉淀,并將生物素miR-24用作陰性對照。僅在生物素標(biāo)記的miR-522組中檢測到ALOX15 mRNA。不出所料,miR-522的過度表達與CAF外泌體在阻斷脂質(zhì)ROS的積累,抑制蛋白激酶誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和逆轉(zhuǎn)蛋白激酶誘導(dǎo)的MMP升高方面具有相同的作用。抑制劑對miR-522的抑制作用顯示出完全相反的功能。 為了研究miR-522是否與其他類型的細(xì)胞死亡有關(guān),我們分別用凋亡激活劑(stauroporine)和抑制劑(ZVAD-FMK),壞死激活劑(TNF-α)和抑制劑(necrosulfonamid)處理了GC細(xì)胞。stauroporine和TNF-α均導(dǎo)致GC細(xì)胞的細(xì)胞死亡顯著增加,但是miR-522無法降低細(xì)胞死亡的比例。因此,miR-522通過直接靶向GC細(xì)胞中的ALOX15有效地抑制了脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生和鐵死亡。
6.USP7通過穩(wěn)定hnRNPA1促進miR-522分泌
據(jù)報道,hnRNP家族是將一系列mRNA和非編碼RNA包裝到外泌體中所必需的。在當(dāng)前研究中,hnRNPA1已被MS篩選出其在胃腫瘤組織中的上調(diào)作用。IHC分析顯示了USP7,hnRNPA1和ALOX15之間的相關(guān)性。接下來,我們檢查了從上述12種腫瘤組織分離出的原發(fā)性CAF中hnRNPA1和USP7在中高表達。此外,hnRNPA1和USP7的水平都與外泌體miR-522正相關(guān),這暗示USP7和hnRNPA1參與了CAFs的miR-522分泌。 有趣的是,與去泛素化相關(guān)的USP7似乎在增加hnRNPA1水平方面起著重要作用。
為了進一步研究USP7,hnRNPA1和miR-522之間的內(nèi)部聯(lián)系,構(gòu)建了包含hnRNPA1或USP7編碼序列以及這兩個基因的siRNA的質(zhì)粒。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了hnRNPA1和USP7的表達,而siRNA的應(yīng)用導(dǎo)致這兩個基因的急劇減少。 hnRNPA1或USP7在CAFs中的過表達促進了miR-522向外泌體的包裝。 然而,兩個基因的敲除相對降低了exo-miR-522的水平?;貜?fù)實驗表明,過度表達的hnRNPA1或USP7部分抵消了各自siRNA對exo-miR-522的作用。接下來,可以使用抗hnRNPA1抗體在免疫沉淀測定的產(chǎn)物中檢測到USP7,反之亦然。此外,USP7還顯示與hnRNA1泛素化水平呈負(fù)相關(guān)。總體而言,這些結(jié)果表明,USP7通過去泛素化作用使CAF中的hnRNPA1穩(wěn)定下來,導(dǎo)致外泌體miR-522的分泌增加。
7.hnRNPA1直接介導(dǎo)miR-522包裝到CAF衍生的外來體中
為了進一步驗證hnRNPA1在將miR-522選擇性包裝入外泌體中的作用,使用RBPDB預(yù)測了潛在的miR-522結(jié)合蛋白。我們還為PABPC1和ACO1設(shè)計了siRNA,并且PABPC1和ACO1都明顯被siRNA抑制。這些siRNA的轉(zhuǎn)染對CAF中miR-522的表達影響很小,是hnRNPA1而不是PABPC1和ACO1的下調(diào)顯著降低了CAF外泌體中miR-522的水平。用生物素標(biāo)記野生型和突變的miR-522,并將其轉(zhuǎn)染到CAF中,然后進行免疫沉淀。結(jié)果表明,使用野生型生物素-miR-522在co-IP生產(chǎn)中僅檢測到hnRNPA1。通過使用0.4μm的聚酯膜共培養(yǎng)原代CAF和SGC7901細(xì)胞。簡而言之,將Cy3標(biāo)記的miR-522轉(zhuǎn)染到CAF中,并且來自CAF的外泌體通過膜與較低的GC細(xì)胞融合。在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中都可以清楚地檢測到Cys-miR-522,并且CAF中hnRNPA1的沉默可阻止cys-miR-522從CAF轉(zhuǎn)移至GC細(xì)胞。因此,這些數(shù)據(jù)提供了直接的證據(jù),表明hnRNPA1在介導(dǎo)miR-522到CAF外泌體的包裝中起著重要的作用。
8.化療藥物毒性通過激活USP7 / hnRNPA1途徑促進CAF分泌miR-522
為了獲得CAF中由化療引起的損傷反應(yīng),我們檢查了用亞致死劑量的順鉑或紫杉醇處理過的GC細(xì)胞。順鉑和紫杉醇對CAFs細(xì)胞活力的抑制作用。,順鉑或紫杉醇均能促進CAF中USP7和hnRNPA1的表達;藥物毒性還增強了hnRNPA1的去泛素化作用。該結(jié)果表明,化療誘導(dǎo)的損傷可通過增加USP7的表達并減少hnRNPA1的泛素化來促進miR-522包裝入外泌體。將從順鉑(Cis-CAF外泌體)或紫杉醇(Pac-CAF外泌體)處理的CAF中分離出的外泌體與GC細(xì)胞共培養(yǎng),它們顯示出比對照CAF外泌體更大的抑制ALOX15蛋白表達的能力,而不會影響ALOX15轉(zhuǎn)錄。Cis-CAF外泌體和Pac-CAF外泌體在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中均能更有效地減少脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生,并抑制蛋白抑制素引起的肥大癥。在培養(yǎng)基中添加順鉑極大地導(dǎo)致了GC細(xì)胞的高死亡率,而順式CAF外泌體和Pac-CAF外泌體則降低了死亡率。這些體外實驗提供了證據(jù),證明CAF外泌體有助于降低化療期間的藥物敏感性。
9.USP7 / hnRNPA1 / miR-522在調(diào)節(jié)胃腫瘤生長和化學(xué)敏感性中的體內(nèi)作用
最后,在體內(nèi)評估了USP7 / hnRNPA1 / miR-522軸在影響腫瘤生長和化學(xué)治療功效中的作用。通過使用shRNA的慢病毒,分別產(chǎn)生了USP7,hnRNPA1和miR-522敲低的三種胃CAF株,并將這些胞株與SGC7901細(xì)胞混合用于小鼠皮下腫瘤植入。從第10天起每5天向這些荷瘤小鼠注入順鉑(5μg/ g)或生理鹽水,并在第30天收獲腫瘤。在CAF中敲除USP7,hnRNPA1或miR-522可明顯抑制腫瘤生長并增強對順鉑的敏感性,但上調(diào)了脂質(zhì)ROS的水平。敲除USP7會降低hnRNPA1蛋白質(zhì)水平。而CAF中三個基因的抑制都會導(dǎo)致癌細(xì)胞中ALOX15的上調(diào)。進行了使用抗α-SMA抗體的IHC分析,顯示慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)不會影響CAF在體內(nèi)的增殖。順鉑的處理相對促進了CAFs中USP7 / hnRNPA1以及癌細(xì)胞中ALOX15的表達,但ALOX15的mRNA幾乎沒有變化。從這些小鼠中分離出血漿外泌體,外泌體miR-522的水平在USP7-KD和hnRNPA1-KD組中急劇下降,在miR-522-KD組中最低。鐵死亡標(biāo)志物PYGS2明顯上調(diào),而凋亡的標(biāo)志物CASP3隨著CAF中USP7,hnRNPA1和miR-522的敲低而略有增加。
10.USP7/hnRNPA1/exo-miR-522通路對腫瘤移植小鼠生存的影響
USP7,hnRNPA1和miR-522的表達受抑制延長了荷瘤小鼠的生存期,順鉑組的小鼠比用鹽水治療的小鼠具有更好的生存期。
結(jié) 論:
該研究闡明了TME衍生的外泌體通過轉(zhuǎn)運特殊的信號傳遞信息在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的鐵死亡中的新作用。這項研究還提供了一種新的想法,即通過阻止特定的miRNA包裝到外泌體中來觸發(fā)腫瘤中的細(xì)胞死亡。