CAF分泌的miR-522可抑制鐵死亡并促進(jìn)胃癌獲得性耐藥
欄目：最新研究動(dòng)態(tài)
發(fā)布時(shí)間：2020-07-21
鐵死亡（Ferroptosis）是一種調(diào)控細(xì)胞死亡的新形式，涉及鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化物（脂質(zhì)-ROS）的積累，并導(dǎo)致細(xì)胞致命性損害...
鐵死亡（Ferroptosis）是一種調(diào)控細(xì)胞死亡的新形式，涉及鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化物（脂質(zhì)-ROS）的積累，并導(dǎo)致細(xì)胞致命性損害。最近的研究已經(jīng)確定鐵死亡在介導(dǎo)腫瘤的發(fā)展和耐藥性在某些類型的癌癥中的重要作用，但其具體分子機(jī)制仍然知之甚少。今年2月，來(lái)自天津醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在Molecular Cancer上發(fā)表了一篇題名為：CAF secreted miR-522 suppresses ferroptosis and promotes acquired chemo-resistance in gastric cancer的文章。該文章主要講述了CAF通過(guò)靶向ALOX15并阻斷脂質(zhì)ROS的積累，分泌外泌體miR-522來(lái)抑制癌細(xì)胞的鐵死亡。包括USP7，hnRNPA1，exo-miR-522和ALOX15在內(nèi)的細(xì)胞間途徑揭示了胃癌（GC）獲得化療耐藥性的新機(jī)制。
結(jié) 果：
1.GC中與鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因的篩選
首先使用質(zhì)譜比較GC特異性蛋白，與癌旁組織（P）相比，一組蛋白在GC腫瘤組織（T）中明顯失調(diào)。 ALOX15是導(dǎo)致ferroptosis的關(guān)鍵基因之一，顯示出急劇下降，而腫瘤組織中USP7和hnRNPA1的水平明顯升高。隨后，在12例胃癌患者中通過(guò)WB和RT-qPCR分析測(cè)量ALOX15蛋白和mRNA表達(dá)ALXO15蛋白總體呈下降趨勢(shì)，但ALOX15 mRNA沒(méi)有明顯變化。因此，ALOX15主要在轉(zhuǎn)錄后水平受GC細(xì)胞的調(diào)節(jié)。通過(guò)IHC分析檢查了ALOX15的分布，并且ALOX15主要在癌旁組織的腺細(xì)胞中表達(dá)，并在腺瘤細(xì)胞中少量表達(dá)。根據(jù)ALOX15蛋白水平的平均值，將GC患者分為ALOX15高組（n = 77）和ALOX15低組（n = 86）。 高水平的ALOX15蛋白還與胃癌患者更好的總體生存率（OS）相關(guān)，這表明ALOX15可以作為GC中的一種抗癌因子。由于脂質(zhì)ROS是ALOX15產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物，因此，腫瘤組織中的脂質(zhì)ROS水平明顯降低（圖與ALOX15正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，ALOX15在介導(dǎo)胃腫瘤中脂質(zhì)-ROS產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用。
通過(guò)超速離心分離正常受試者和GC患者的血清外泌體，經(jīng)鑒定具有外泌體特征。由于在ALOX15蛋白和ALOX15 mRNA之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性，推斷ALOX15在轉(zhuǎn)錄后水平受miRNA調(diào)控。預(yù)測(cè)miR-522與ALOX15 mRNA相互作用。據(jù)報(bào)道，miR-522促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌，結(jié)腸直腸癌和肝細(xì)胞癌的腫瘤進(jìn)展，但尚未明確miR-522在胃癌中的作用。我們的數(shù)據(jù)顯示，GC患者的血清外泌體和腫瘤組織中的miR-522均上調(diào)，并且exo-miR-522與腫瘤等級(jí)呈正相關(guān)。 此外，發(fā)現(xiàn)miR-522與ALOX5表達(dá)以及脂質(zhì)ROS負(fù)相關(guān)。根據(jù)miR-522的平均值，將GC患者分為miR-522高組（n = 184）和miR-522低組（n = 162）。生存曲線是從在線數(shù)據(jù)庫(kù)生成的，并且高水平的miR-522預(yù)測(cè)GC的存活率很差。 因此，這些結(jié)果表明miR-522，ALOX15和脂質(zhì)-ROS積累之間潛在的臨床相關(guān)性。
盡管證明外泌體miR-522在GC中明顯上調(diào)，但miR-522的起源仍不清楚。分離腫瘤組織中的CAFs和癌旁組織中的正常成纖維細(xì)胞（NFs），并在原代細(xì)胞和外泌體中測(cè)量miR-522的水平。CAF中的標(biāo)記α-SMA，F(xiàn)AP和FSP1表達(dá)量明顯高于NF。GC細(xì)胞的標(biāo)志物CEA和CK-18在NF和CAF中不表達(dá)，腫瘤細(xì)胞不表達(dá)α-SMA，F(xiàn)AP和FSP1。CAF 在三種細(xì)胞中miR-522表達(dá)最高，提取外泌體并鑒定，CAF外泌體中miR-522的含量在這三種外泌體中占主導(dǎo)地位。不出所料，源自CAF的外泌體miR-522也顯示與ALOX15和脂質(zhì)ROS呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，GC腫瘤微環(huán)境中的exo-miR-522主要由CAF分泌。
為了測(cè)試源自CAF的exo-miR-522在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的肥大性中的功能，分離了CAF外泌體并與人胃癌細(xì)胞系共培養(yǎng)。CAF中miR-522的量是GC細(xì)胞系的6倍，外泌體中也觀察到了相同的趨勢(shì)。將CAF外泌體與GC細(xì)胞共培養(yǎng)，并在6 h時(shí)在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中均檢測(cè)到PKH-26標(biāo)記的CAF外泌體，表明CAF衍生的外泌體可以與GC細(xì)胞有效融合。CAF外泌體miR-522可顯著抑制GC細(xì)胞中ALOX15的表達(dá)，而不會(huì)影響ALOX15 mRNA的含量。此外，已證明exo-miR-522可有效抑制GC細(xì)胞中蛋白激酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)ROS積累和鐵死亡。 經(jīng)過(guò)Eaststin處理的SGC7901細(xì)胞顯示出明顯的線粒體膜電位（MMP）升高，并且CAF外泌體部分逆轉(zhuǎn)了Eaststin對(duì)線粒體的損傷。總而言之，CAF分泌的exo-miR-522抑制了ALOX15的表達(dá)并下調(diào)了GC細(xì)胞中鐵死亡的水平。
預(yù)測(cè)將三種miRNA，miR-522，miR-106a和miR-125b作為ALOX15的上游調(diào)節(jié)子，但是，miR-106a和miR-125b在CAF和NF之間顯示出很小的差異。因此，選擇了miR-522作為ALOX15的潛在調(diào)節(jié)劑。隨后，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，進(jìn)一步揭示了miR-522和ALOX15 mRNA的直接接觸。構(gòu)建了含有miR-522結(jié)合區(qū)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并將含有miR-522結(jié)合位點(diǎn)（mut）的反向序列的質(zhì)粒用作陰性對(duì)照。miR-522模擬物的轉(zhuǎn)染或CAF外泌體的治療會(huì)導(dǎo)致螢光素酶活性的顯著抑制。而敲除miR-522則相對(duì)增加了螢光素酶的水平。過(guò)表達(dá)的miR-522顯著降低了ALOX15的水平，而轉(zhuǎn)染miR-522抑制劑促進(jìn)了SGC7901和MKN45細(xì)胞中ALOX15的表達(dá)。但是在miR-522處理下ALOX15的mRNA幾乎沒(méi)有變化，這表明miR-522在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控ALOX15的表達(dá)。在SGC7901細(xì)胞中使用生物素標(biāo)記的miR-522進(jìn)行免疫沉淀，并將生物素miR-24用作陰性對(duì)照。僅在生物素標(biāo)記的miR-522組中檢測(cè)到ALOX15 mRNA。不出所料，miR-522的過(guò)度表達(dá)與CAF外泌體在阻斷脂質(zhì)ROS的積累，抑制蛋白激酶誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和逆轉(zhuǎn)蛋白激酶誘導(dǎo)的MMP升高方面具有相同的作用。抑制劑對(duì)miR-522的抑制作用顯示出完全相反的功能。 為了研究miR-522是否與其他類型的細(xì)胞死亡有關(guān)，我們分別用凋亡激活劑（stauroporine）和抑制劑（ZVAD-FMK），壞死激活劑（TNF-α）和抑制劑（necrosulfonamid）處理了GC細(xì)胞。stauroporine和TNF-α均導(dǎo)致GC細(xì)胞的細(xì)胞死亡顯著增加，但是miR-522無(wú)法降低細(xì)胞死亡的比例。因此，miR-522通過(guò)直接靶向GC細(xì)胞中的ALOX15有效地抑制了脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生和鐵死亡。
據(jù)報(bào)道，hnRNP家族是將一系列mRNA和非編碼RNA包裝到外泌體中所必需的。在當(dāng)前研究中，hnRNPA1已被MS篩選出其在胃腫瘤組織中的上調(diào)作用。IHC分析顯示了USP7，hnRNPA1和ALOX15之間的相關(guān)性。接下來(lái)，我們檢查了從上述12種腫瘤組織分離出的原發(fā)性CAF中hnRNPA1和USP7在中高表達(dá)。此外，hnRNPA1和USP7的水平都與外泌體miR-522正相關(guān)，這暗示USP7和hnRNPA1參與了CAFs的miR-522分泌。 有趣的是，與去泛素化相關(guān)的USP7似乎在增加hnRNPA1水平方面起著重要作用。
為了進(jìn)一步研究USP7，hnRNPA1和miR-522之間的內(nèi)部聯(lián)系，構(gòu)建了包含hnRNPA1或USP7編碼序列以及這兩個(gè)基因的siRNA的質(zhì)粒。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了hnRNPA1和USP7的表達(dá)，而siRNA的應(yīng)用導(dǎo)致這兩個(gè)基因的急劇減少。 hnRNPA1或USP7在CAFs中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了miR-522向外泌體的包裝。 然而，兩個(gè)基因的敲除相對(duì)降低了exo-miR-522的水平?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)度表達(dá)的hnRNPA1或USP7部分抵消了各自siRNA對(duì)exo-miR-522的作用。接下來(lái)，可以使用抗hnRNPA1抗體在免疫沉淀測(cè)定的產(chǎn)物中檢測(cè)到USP7，反之亦然。此外，USP7還顯示與hnRNA1泛素化水平呈負(fù)相關(guān)。總體而言，這些結(jié)果表明，USP7通過(guò)去泛素化作用使CAF中的hnRNPA1穩(wěn)定下來(lái)，導(dǎo)致外泌體miR-522的分泌增加。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證hnRNPA1在將miR-522選擇性包裝入外泌體中的作用，使用RBPDB預(yù)測(cè)了潛在的miR-522結(jié)合蛋白。我們還為PABPC1和ACO1設(shè)計(jì)了siRNA，并且PABPC1和ACO1都明顯被siRNA抑制。這些siRNA的轉(zhuǎn)染對(duì)CAF中miR-522的表達(dá)影響很小，是hnRNPA1而不是PABPC1和ACO1的下調(diào)顯著降低了CAF外泌體中miR-522的水平。用生物素標(biāo)記野生型和突變的miR-522，并將其轉(zhuǎn)染到CAF中，然后進(jìn)行免疫沉淀。結(jié)果表明，使用野生型生物素-miR-522在co-IP生產(chǎn)中僅檢測(cè)到hnRNPA1。通過(guò)使用0.4μm的聚酯膜共培養(yǎng)原代CAF和SGC7901細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將Cy3標(biāo)記的miR-522轉(zhuǎn)染到CAF中，并且來(lái)自CAF的外泌體通過(guò)膜與較低的GC細(xì)胞融合。在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中都可以清楚地檢測(cè)到Cys-miR-522，并且CAF中hnRNPA1的沉默可阻止cys-miR-522從CAF轉(zhuǎn)移至GC細(xì)胞。因此，這些數(shù)據(jù)提供了直接的證據(jù)，表明hnRNPA1在介導(dǎo)miR-522到CAF外泌體的包裝中起著重要的作用。
為了獲得CAF中由化療引起的損傷反應(yīng)，我們檢查了用亞致死劑量的順鉑或紫杉醇處理過(guò)的GC細(xì)胞。順鉑和紫杉醇對(duì)CAFs細(xì)胞活力的抑制作用。，順鉑或紫杉醇均能促進(jìn)CAF中USP7和hnRNPA1的表達(dá);藥物毒性還增強(qiáng)了hnRNPA1的去泛素化作用。該結(jié)果表明，化療誘導(dǎo)的損傷可通過(guò)增加USP7的表達(dá)并減少hnRNPA1的泛素化來(lái)促進(jìn)miR-522包裝入外泌體。將從順鉑（Cis-CAF外泌體）或紫杉醇（Pac-CAF外泌體）處理的CAF中分離出的外泌體與GC細(xì)胞共培養(yǎng)，它們顯示出比對(duì)照CAF外泌體更大的抑制ALOX15蛋白表達(dá)的能力，而不會(huì)影響ALOX15轉(zhuǎn)錄。Cis-CAF外泌體和Pac-CAF外泌體在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中均能更有效地減少脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生，并抑制蛋白抑制素引起的肥大癥。在培養(yǎng)基中添加順鉑極大地導(dǎo)致了GC細(xì)胞的高死亡率，而順式CAF外泌體和Pac-CAF外泌體則降低了死亡率。這些體外實(shí)驗(yàn)提供了證據(jù)，證明CAF外泌體有助于降低化療期間的藥物敏感性。
最后，在體內(nèi)評(píng)估了USP7 / hnRNPA1 / miR-522軸在影響腫瘤生長(zhǎng)和化學(xué)治療功效中的作用。通過(guò)使用shRNA的慢病毒，分別產(chǎn)生了USP7，hnRNPA1和miR-522敲低的三種胃CAF株，并將這些胞株與SGC7901細(xì)胞混合用于小鼠皮下腫瘤植入。從第10天起每5天向這些荷瘤小鼠注入順鉑（5μg/ g）或生理鹽水，并在第30天收獲腫瘤。在CAF中敲除USP7，hnRNPA1或miR-522可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)并增強(qiáng)對(duì)順鉑的敏感性，但上調(diào)了脂質(zhì)ROS的水平。敲除USP7會(huì)降低hnRNPA1蛋白質(zhì)水平。而CAF中三個(gè)基因的抑制都會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞中ALOX15的上調(diào)。進(jìn)行了使用抗α-SMA抗體的IHC分析，顯示慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)不會(huì)影響CAF在體內(nèi)的增殖。順鉑的處理相對(duì)促進(jìn)了CAFs中USP7 / hnRNPA1以及癌細(xì)胞中ALOX15的表達(dá)，但ALOX15的mRNA幾乎沒(méi)有變化。從這些小鼠中分離出血漿外泌體，外泌體miR-522的水平在USP7-KD和hnRNPA1-KD組中急劇下降，在miR-522-KD組中最低。鐵死亡標(biāo)志物PYGS2明顯上調(diào)，而凋亡的標(biāo)志物CASP3隨著CAF中USP7，hnRNPA1和miR-522的敲低而略有增加。
USP7，hnRNPA1和miR-522的表達(dá)受抑制延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存期，順鉑組的小鼠比用鹽水治療的小鼠具有更好的生存期。
該研究闡明了TME衍生的外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)特殊的信號(hào)傳遞信息在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的鐵死亡中的新作用。這項(xiàng)研究還提供了一種新的想法，即通過(guò)阻止特定的miRNA包裝到外泌體中來(lái)觸發(fā)腫瘤中的細(xì)胞死亡。
1.GC中與鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因的篩選
首先使用質(zhì)譜比較GC特異性蛋白，與癌旁組織（P）相比，一組蛋白在GC腫瘤組織（T）中明顯失調(diào)。 ALOX15是導(dǎo)致ferroptosis的關(guān)鍵基因之一，顯示出急劇下降，而腫瘤組織中USP7和hnRNPA1的水平明顯升高。隨后，在12例胃癌患者中通過(guò)WB和RT-qPCR分析測(cè)量ALOX15蛋白和mRNA表達(dá)ALXO15蛋白總體呈下降趨勢(shì)，但ALOX15 mRNA沒(méi)有明顯變化。因此，ALOX15主要在轉(zhuǎn)錄后水平受GC細(xì)胞的調(diào)節(jié)。通過(guò)IHC分析檢查了ALOX15的分布，并且ALOX15主要在癌旁組織的腺細(xì)胞中表達(dá)，并在腺瘤細(xì)胞中少量表達(dá)。根據(jù)ALOX15蛋白水平的平均值，將GC患者分為ALOX15高組（n = 77）和ALOX15低組（n = 86）。 高水平的ALOX15蛋白還與胃癌患者更好的總體生存率（OS）相關(guān)，這表明ALOX15可以作為GC中的一種抗癌因子。由于脂質(zhì)ROS是ALOX15產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物，因此，腫瘤組織中的脂質(zhì)ROS水平明顯降低（圖與ALOX15正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，ALOX15在介導(dǎo)胃腫瘤中脂質(zhì)-ROS產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用。
通過(guò)超速離心分離正常受試者和GC患者的血清外泌體，經(jīng)鑒定具有外泌體特征。由于在ALOX15蛋白和ALOX15 mRNA之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性，推斷ALOX15在轉(zhuǎn)錄后水平受miRNA調(diào)控。預(yù)測(cè)miR-522與ALOX15 mRNA相互作用。據(jù)報(bào)道，miR-522促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌，結(jié)腸直腸癌和肝細(xì)胞癌的腫瘤進(jìn)展，但尚未明確miR-522在胃癌中的作用。我們的數(shù)據(jù)顯示，GC患者的血清外泌體和腫瘤組織中的miR-522均上調(diào)，并且exo-miR-522與腫瘤等級(jí)呈正相關(guān)。 此外，發(fā)現(xiàn)miR-522與ALOX5表達(dá)以及脂質(zhì)ROS負(fù)相關(guān)。根據(jù)miR-522的平均值，將GC患者分為miR-522高組（n = 184）和miR-522低組（n = 162）。生存曲線是從在線數(shù)據(jù)庫(kù)生成的，并且高水平的miR-522預(yù)測(cè)GC的存活率很差。 因此，這些結(jié)果表明miR-522，ALOX15和脂質(zhì)-ROS積累之間潛在的臨床相關(guān)性。
盡管證明外泌體miR-522在GC中明顯上調(diào)，但miR-522的起源仍不清楚。分離腫瘤組織中的CAFs和癌旁組織中的正常成纖維細(xì)胞（NFs），并在原代細(xì)胞和外泌體中測(cè)量miR-522的水平。CAF中的標(biāo)記α-SMA，F(xiàn)AP和FSP1表達(dá)量明顯高于NF。GC細(xì)胞的標(biāo)志物CEA和CK-18在NF和CAF中不表達(dá)，腫瘤細(xì)胞不表達(dá)α-SMA，F(xiàn)AP和FSP1。CAF 在三種細(xì)胞中miR-522表達(dá)最高，提取外泌體并鑒定，CAF外泌體中miR-522的含量在這三種外泌體中占主導(dǎo)地位。不出所料，源自CAF的外泌體miR-522也顯示與ALOX15和脂質(zhì)ROS呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，GC腫瘤微環(huán)境中的exo-miR-522主要由CAF分泌。
為了測(cè)試源自CAF的exo-miR-522在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的肥大性中的功能，分離了CAF外泌體并與人胃癌細(xì)胞系共培養(yǎng)。CAF中miR-522的量是GC細(xì)胞系的6倍，外泌體中也觀察到了相同的趨勢(shì)。將CAF外泌體與GC細(xì)胞共培養(yǎng)，并在6 h時(shí)在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中均檢測(cè)到PKH-26標(biāo)記的CAF外泌體，表明CAF衍生的外泌體可以與GC細(xì)胞有效融合。CAF外泌體miR-522可顯著抑制GC細(xì)胞中ALOX15的表達(dá)，而不會(huì)影響ALOX15 mRNA的含量。此外，已證明exo-miR-522可有效抑制GC細(xì)胞中蛋白激酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)ROS積累和鐵死亡。 經(jīng)過(guò)Eaststin處理的SGC7901細(xì)胞顯示出明顯的線粒體膜電位（MMP）升高，并且CAF外泌體部分逆轉(zhuǎn)了Eaststin對(duì)線粒體的損傷。總而言之，CAF分泌的exo-miR-522抑制了ALOX15的表達(dá)并下調(diào)了GC細(xì)胞中鐵死亡的水平。
預(yù)測(cè)將三種miRNA，miR-522，miR-106a和miR-125b作為ALOX15的上游調(diào)節(jié)子，但是，miR-106a和miR-125b在CAF和NF之間顯示出很小的差異。因此，選擇了miR-522作為ALOX15的潛在調(diào)節(jié)劑。隨后，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，進(jìn)一步揭示了miR-522和ALOX15 mRNA的直接接觸。構(gòu)建了含有miR-522結(jié)合區(qū)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并將含有miR-522結(jié)合位點(diǎn)（mut）的反向序列的質(zhì)粒用作陰性對(duì)照。miR-522模擬物的轉(zhuǎn)染或CAF外泌體的治療會(huì)導(dǎo)致螢光素酶活性的顯著抑制。而敲除miR-522則相對(duì)增加了螢光素酶的水平。過(guò)表達(dá)的miR-522顯著降低了ALOX15的水平，而轉(zhuǎn)染miR-522抑制劑促進(jìn)了SGC7901和MKN45細(xì)胞中ALOX15的表達(dá)。但是在miR-522處理下ALOX15的mRNA幾乎沒(méi)有變化，這表明miR-522在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控ALOX15的表達(dá)。在SGC7901細(xì)胞中使用生物素標(biāo)記的miR-522進(jìn)行免疫沉淀，并將生物素miR-24用作陰性對(duì)照。僅在生物素標(biāo)記的miR-522組中檢測(cè)到ALOX15 mRNA。不出所料，miR-522的過(guò)度表達(dá)與CAF外泌體在阻斷脂質(zhì)ROS的積累，抑制蛋白激酶誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和逆轉(zhuǎn)蛋白激酶誘導(dǎo)的MMP升高方面具有相同的作用。抑制劑對(duì)miR-522的抑制作用顯示出完全相反的功能。 為了研究miR-522是否與其他類型的細(xì)胞死亡有關(guān)，我們分別用凋亡激活劑（stauroporine）和抑制劑（ZVAD-FMK），壞死激活劑（TNF-α）和抑制劑（necrosulfonamid）處理了GC細(xì)胞。stauroporine和TNF-α均導(dǎo)致GC細(xì)胞的細(xì)胞死亡顯著增加，但是miR-522無(wú)法降低細(xì)胞死亡的比例。因此，miR-522通過(guò)直接靶向GC細(xì)胞中的ALOX15有效地抑制了脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生和鐵死亡。
據(jù)報(bào)道，hnRNP家族是將一系列mRNA和非編碼RNA包裝到外泌體中所必需的。在當(dāng)前研究中，hnRNPA1已被MS篩選出其在胃腫瘤組織中的上調(diào)作用。IHC分析顯示了USP7，hnRNPA1和ALOX15之間的相關(guān)性。接下來(lái)，我們檢查了從上述12種腫瘤組織分離出的原發(fā)性CAF中hnRNPA1和USP7在中高表達(dá)。此外，hnRNPA1和USP7的水平都與外泌體miR-522正相關(guān)，這暗示USP7和hnRNPA1參與了CAFs的miR-522分泌。 有趣的是，與去泛素化相關(guān)的USP7似乎在增加hnRNPA1水平方面起著重要作用。
為了進(jìn)一步研究USP7，hnRNPA1和miR-522之間的內(nèi)部聯(lián)系，構(gòu)建了包含hnRNPA1或USP7編碼序列以及這兩個(gè)基因的siRNA的質(zhì)粒。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了hnRNPA1和USP7的表達(dá)，而siRNA的應(yīng)用導(dǎo)致這兩個(gè)基因的急劇減少。 hnRNPA1或USP7在CAFs中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了miR-522向外泌體的包裝。 然而，兩個(gè)基因的敲除相對(duì)降低了exo-miR-522的水平?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)度表達(dá)的hnRNPA1或USP7部分抵消了各自siRNA對(duì)exo-miR-522的作用。接下來(lái)，可以使用抗hnRNPA1抗體在免疫沉淀測(cè)定的產(chǎn)物中檢測(cè)到USP7，反之亦然。此外，USP7還顯示與hnRNA1泛素化水平呈負(fù)相關(guān)。總體而言，這些結(jié)果表明，USP7通過(guò)去泛素化作用使CAF中的hnRNPA1穩(wěn)定下來(lái)，導(dǎo)致外泌體miR-522的分泌增加。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證hnRNPA1在將miR-522選擇性包裝入外泌體中的作用，使用RBPDB預(yù)測(cè)了潛在的miR-522結(jié)合蛋白。我們還為PABPC1和ACO1設(shè)計(jì)了siRNA，并且PABPC1和ACO1都明顯被siRNA抑制。這些siRNA的轉(zhuǎn)染對(duì)CAF中miR-522的表達(dá)影響很小，是hnRNPA1而不是PABPC1和ACO1的下調(diào)顯著降低了CAF外泌體中miR-522的水平。用生物素標(biāo)記野生型和突變的miR-522，并將其轉(zhuǎn)染到CAF中，然后進(jìn)行免疫沉淀。結(jié)果表明，使用野生型生物素-miR-522在co-IP生產(chǎn)中僅檢測(cè)到hnRNPA1。通過(guò)使用0.4μm的聚酯膜共培養(yǎng)原代CAF和SGC7901細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將Cy3標(biāo)記的miR-522轉(zhuǎn)染到CAF中，并且來(lái)自CAF的外泌體通過(guò)膜與較低的GC細(xì)胞融合。在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中都可以清楚地檢測(cè)到Cys-miR-522，并且CAF中hnRNPA1的沉默可阻止cys-miR-522從CAF轉(zhuǎn)移至GC細(xì)胞。因此，這些數(shù)據(jù)提供了直接的證據(jù)，表明hnRNPA1在介導(dǎo)miR-522到CAF外泌體的包裝中起著重要的作用。
為了獲得CAF中由化療引起的損傷反應(yīng)，我們檢查了用亞致死劑量的順鉑或紫杉醇處理過(guò)的GC細(xì)胞。順鉑和紫杉醇對(duì)CAFs細(xì)胞活力的抑制作用。，順鉑或紫杉醇均能促進(jìn)CAF中USP7和hnRNPA1的表達(dá);藥物毒性還增強(qiáng)了hnRNPA1的去泛素化作用。該結(jié)果表明，化療誘導(dǎo)的損傷可通過(guò)增加USP7的表達(dá)并減少hnRNPA1的泛素化來(lái)促進(jìn)miR-522包裝入外泌體。將從順鉑（Cis-CAF外泌體）或紫杉醇（Pac-CAF外泌體）處理的CAF中分離出的外泌體與GC細(xì)胞共培養(yǎng)，它們顯示出比對(duì)照CAF外泌體更大的抑制ALOX15蛋白表達(dá)的能力，而不會(huì)影響ALOX15轉(zhuǎn)錄。Cis-CAF外泌體和Pac-CAF外泌體在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中均能更有效地減少脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生，并抑制蛋白抑制素引起的肥大癥。在培養(yǎng)基中添加順鉑極大地導(dǎo)致了GC細(xì)胞的高死亡率，而順式CAF外泌體和Pac-CAF外泌體則降低了死亡率。這些體外實(shí)驗(yàn)提供了證據(jù)，證明CAF外泌體有助于降低化療期間的藥物敏感性。
最后，在體內(nèi)評(píng)估了USP7 / hnRNPA1 / miR-522軸在影響腫瘤生長(zhǎng)和化學(xué)治療功效中的作用。通過(guò)使用shRNA的慢病毒，分別產(chǎn)生了USP7，hnRNPA1和miR-522敲低的三種胃CAF株，并將這些胞株與SGC7901細(xì)胞混合用于小鼠皮下腫瘤植入。從第10天起每5天向這些荷瘤小鼠注入順鉑（5μg/ g）或生理鹽水，并在第30天收獲腫瘤。在CAF中敲除USP7，hnRNPA1或miR-522可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)并增強(qiáng)對(duì)順鉑的敏感性，但上調(diào)了脂質(zhì)ROS的水平。敲除USP7會(huì)降低hnRNPA1蛋白質(zhì)水平。而CAF中三個(gè)基因的抑制都會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞中ALOX15的上調(diào)。進(jìn)行了使用抗α-SMA抗體的IHC分析，顯示慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)不會(huì)影響CAF在體內(nèi)的增殖。順鉑的處理相對(duì)促進(jìn)了CAFs中USP7 / hnRNPA1以及癌細(xì)胞中ALOX15的表達(dá)，但ALOX15的mRNA幾乎沒(méi)有變化。從這些小鼠中分離出血漿外泌體，外泌體miR-522的水平在USP7-KD和hnRNPA1-KD組中急劇下降，在miR-522-KD組中最低。鐵死亡標(biāo)志物PYGS2明顯上調(diào)，而凋亡的標(biāo)志物CASP3隨著CAF中USP7，hnRNPA1和miR-522的敲低而略有增加。
USP7，hnRNPA1和miR-522的表達(dá)受抑制延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存期，順鉑組的小鼠比用鹽水治療的小鼠具有更好的生存期。
該研究闡明了TME衍生的外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)特殊的信號(hào)傳遞信息在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的鐵死亡中的新作用。這項(xiàng)研究還提供了一種新的想法，即通過(guò)阻止特定的miRNA包裝到外泌體中來(lái)觸發(fā)腫瘤中的細(xì)胞死亡。