腎細胞癌(RCC)是泌尿外科中導(dǎo)致患者死亡的第二大腫瘤,僅在2018年就有約403426個新增病例。但是其治療始終沒有非常樂觀的進展。circRNA在許多疾病中被證實具有調(diào)控作用,并可作為治療靶標,但是在RCC中的作用尚不清楚。本文旨在探究RCC中是否存在某個關(guān)鍵circRNA參與調(diào)控了RCC的惡性進展,并于今年6月5日新近發(fā)表在《Molecular Cancer》(IF:10.679)期刊上。
結(jié) 果:
1、CircTLK1在RCC組織中過表達并于其不良預(yù)后有關(guān)
通過腎上皮細胞和RCC細胞測序獲得差異表達序列,F(xiàn)ig. 1a是最顯著差異的10個circRNA。CircTLK1不僅在RCC細胞系和RCC組織中高表達,在術(shù)后轉(zhuǎn)移中RCC病人中也高表達,并預(yù)示著不良預(yù)后(Fig. 1b-f)。CircTLK1長247nt,包含兩個外顯子,不可被RNase R消化(Fig. 1g-i)。
圖1 CircTLK1在RCC組織中過表達并于其不良預(yù)后有關(guān)
2、敲除circTLK1抑制RCC細胞增殖
shRNA-2可顯著抑制三種細胞系中circTLK1的表達,但對TLK1的表達沒有影響(Fig.a-c)。此外,使用shRNA-2干擾掉circTLK1的表達后RCC細胞的增殖能力顯著下降。
圖2敲除circTLK1抑制RCC細胞增殖
3、敲除circTLK1抑制RCC細胞遷移和侵襲
如圖3a-c所示,shRNA-2干擾circTLK1的表達后RCC細胞的遷移和侵襲能力顯著下降。鑒于這種影響,作者進一步檢測了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的表達,結(jié)果表明在circTLK1沉默的細胞中,間質(zhì)標記物N-cadherin和vimentin表達明顯下降,而上皮標記物E-cadherin表達在circTLK1抑制的細胞中升高(圖3e)。
圖3敲除circTLK1抑制RCC細胞遷移和侵襲
4、circTLK1作為miR-136-5p海綿
為分析circTLK1的分子途徑,使用FISH和核質(zhì)分離實驗來檢測circTL1K的亞細胞定位,結(jié)果顯示主要分布在細胞質(zhì)(Fig.4a-b),這暗示著circTLK1可能通過捕獲miRNA釋放其靶基因轉(zhuǎn)錄本發(fā)揮功能。在線預(yù)測獲得5個可與circTL1K結(jié)合的miRNA,然后生物素circTL1K探針在RCC細胞中顯著下拉circTLK1,而miR-136-5p是惟一被生物素circTL1K探針下拉的miRNA(Fig.4c-d)。之后熒光素酶實驗進一步證實兩者間的作用關(guān)系(Fig.4e-f)。然而,過表達或敲除circTL1K對RCC細胞中miR-136-5p的表達沒有影響(Fig.4i-j)。這些表明circTLK1對miR-136-5p起海綿吸附作用。
圖4 circTLK1作為miR-136-5p海綿
5、miR-136-5p通過靶向CBX4促進RCC進展
在線預(yù)測miR-136-5p的靶基因有CBX4,GNAS,LUZP6,MSL2,MTMR4和SOCS7(Fig 5a),并進一步通過綜合轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)miR-136-5p與CBX4的表達呈現(xiàn)負相關(guān)(Fig 5b)。熒光素酶實驗顯示共轉(zhuǎn)染miR-136-5p與野生型CBX4質(zhì)粒后熒光素酶活性顯著升高,而轉(zhuǎn)染突變型CBX4則沒有變化(Fig 5c-d)。過表達miR-136-5p抑制了CBX4的mRNA和蛋白質(zhì)水平(Fig 5e-g)。這些表明miR-136-5p直接靶向CBX4。此外,CBX4在RCC組織中上調(diào)表達,且與腫瘤大小和術(shù)后轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(Fig 5i-j)。RCC病人中高表達CBX4具有較低的總體生存率(Fig 5k)。
圖5 CBX4是miR-136-5p的直接靶點
6、CBX4敲除抑制細胞增殖,遷移和侵襲
如圖6所示,使用shRNA干擾CBX4表達后,ACHN 和769-P細胞系的增殖,集落形成,遷移和侵襲能力都顯著下降。此外,CBX4的表達與VEGFA的表達呈正相關(guān),shRNA干擾CBX4表達后VEGFA的表達顯著抑制。
圖6 CBX4敲除抑制細胞增殖,遷移和侵襲
7、過表達CBX4逆轉(zhuǎn)了circTLK1對細胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用
為了探究circTLK1是否通過調(diào)控CBX4的表達改變腫瘤細胞的生物學(xué)功能,作者做了一個circTLK1和CBX4的拯救實驗。如圖7所示,敲除circTLK1明顯抑制了CBX4的mRNA和蛋白質(zhì)水平。CBX4過表達顯著扭轉(zhuǎn)了circTLK1誘導(dǎo)的腫瘤細胞的增殖抑制作用。在細胞的遷移,侵襲,集落形成實驗中得出了一致的結(jié)果。上述表明circTLK1是通過調(diào)控CBX4的表達改變腫瘤細胞的生物學(xué)功能。
圖7過表達CBX4逆轉(zhuǎn)了circTLK1對細胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用
8、circTLK1敲低可抑制體內(nèi)RCC細胞的生長和轉(zhuǎn)移
為了探究在體內(nèi)circTLK1對RCC腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移的作用,構(gòu)建了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染了shcircTLK1的769-P細胞并注射到裸鼠中從而構(gòu)建裸鼠腫瘤移植及肺轉(zhuǎn)移模型。在腫瘤異種移植模型中,與shNC相比,shcircTLK1的小鼠腫瘤明顯更小,腫瘤的體積和和腫瘤也都顯著下降(Fig. 8a-c)。此外,shcircTLK1小鼠體內(nèi)的Ki67,CBX4和VEGFA的表達水平顯著下降(Fig. 8d-e)。在肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型中,shcircTLK1小鼠的肺轉(zhuǎn)移顯著減少(Fig. 8f-h)。在腫瘤異種移植模型中,過表達CBX4逆轉(zhuǎn)了shcircTLK1誘導(dǎo)的生長抑制(Fig. 8i-k)。這些體內(nèi)實驗結(jié)果表明circTLK1可能在促進RCC的體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
圖8 circTLK1敲低可抑制體內(nèi)RCC細胞的生長和轉(zhuǎn)移
總之,作者證明了circTLK1通過海綿吸附miR- 136-5p來調(diào)節(jié)CBX4的表達,從而促進了RCC的生長和轉(zhuǎn)移(圖8l)。
參考文獻:
Li Jianfa., Huang Chenchen., Zou Yifan., Ye Jing., Yu Jing., Gui Yaoting.(2020). CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol. Cancer, 19(1), 103. doi:10.1186/s12943-020-01225-2