分泌體和外泌體用于肺纖維化治療啦！
特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種致命的、無法治愈的肺間質疾病，持續(xù)損傷可導致瘢痕組織形成。隨著纖維化變厚，肺組織失去了促進氣體交換和為細胞提供所需氧氣的能力。目前，除了肺移植外，IPF幾乎沒有治療選擇，也沒有有效的治療方法。在這里，作者提出了利用肺球狀細胞分泌體(LSC-Sec)和外泌體(LSC-Exo)吸入來治療不同模型的肺損傷和纖維化。本文于2020年2月發(fā)表在Nature Communication（IF：11.878）雜志上。
結 果：
1、細胞分泌體減輕博萊霉素（Bleo）誘導的纖維化和凋亡
小鼠PF模型中肺部炎癥通常持續(xù)7天，并在第9天進入纖維化階段，因此，作者在第10天開始干預，以保證治療處于PF疾病階段（Fig. 1a）。在首次組織學檢查后，所有接受Bleo處理組均表現(xiàn)出出血性壞死（Fig. 1b）， LSC-Sec或MSC-Sec處理均可減少壞死。由于Bleo誘導DNA損傷，檢測了細胞分泌體處理對細胞凋亡的影響（Fig. 1c-f）。與PBS組相比，LSC-Sec治療導致肺細胞凋亡減少（Fig. 1d-f）。LSC-Sec和MSC-Sec處理均通過保留肺泡上皮結構（Fig. 1g–h）和減少膠原沉積（Fig. 1i–k）來減少纖維化。只有LSC-Sec能夠減少纖維化面積并將肺泡上皮損傷恢復到健康水平(sham對照組)。
圖1 LSC-Sec吸入逆轉博萊霉素誘導的肺泡上皮細胞損傷
2、分泌體吸入促進血管和肺泡修復
肺泡是遠端氣道的末端結構。肺泡上皮由肺泡1型上皮細胞(AT1)和肺泡2型上皮細胞(AT2)組成，前者介導氣體交換，后者產生和釋放肺表面活性劑、抗氧化劑、細胞因子/趨化因子和其他對肺防御、損傷反應和穩(wěn)態(tài)重要的分子。因此，檢測了分泌體處理后Bleo損傷時AT1和AT2分布的變化，以評估上皮損傷和挽救（Fig. 2a）。AT1標記水通道蛋白5（AQP5）的免疫染色顯示LSC-Sec處理能夠逆轉由Bleo引起的上皮損傷（Fig. 2a-d）。 但是，與PBS處理組相比，在LSC-Sec處理組中肺蛋白溶解產物的免疫印跡顯示AQP5蛋白顯著增加（Fig. 2e, f）。 此外，LSC-Sec處理顯著提高了表面活性蛋白C（ProSPC +）陽性AT2細胞的增殖（Fig. 2a-c），該細胞增殖并分化為AT1細胞。這種現(xiàn)象在MSC-Sec處理中仍然發(fā)生，但程度較低，與PBS組無顯著差異。只有LSC-Sec處理能夠增加PF肺中von Willebrand因子（vWF +）陽性脈管系統(tǒng)的表達（Fig. 2a, b）。與PBS組相比，在分泌體處理組中，ProSPC和vWF肺蛋白水平的免疫印跡顯示增加的趨勢（Fig. 2e, f）。
同時，通過測量α-平滑肌肌動蛋白（αSMA，指示IPF的成肌纖維細胞標志物）的蛋白質水平來檢查纖維化反應（Fig. 2e, f）。與PBS處理的對照組相比，LSC分泌體處理組αSMA表達下降。與PBS組相比，兩個分泌組中肺組織中基質金屬蛋白酶（MMP）2的蛋白表達均呈增加趨勢。采用細胞因子陣列來探究全身細胞因子表達，作為免疫原性的量度。有趣的是，與PBS對照相比，LSCSec的促炎性IL-4表達呈下降趨勢（Fig. 2g, h）。IL-4是呼吸道疾病（例如哮喘）中促炎功能的重要介質。
圖2 LSC-Sec吸入處理促進肺泡修復
3、LSC分泌體治療二氧化硅誘導的肺纖維化
為了評估LSC-Sec的再生作用可以被應用于其他的肺損傷模型，使用二氧化硅誘導肺纖維化。與之前的Bleo研究一樣，使用噴霧器連續(xù)7天給予可吸入細胞分泌體或生理鹽水（Fig. 3a）。在所有處理組，對凋亡細胞的影響均無顯著差異（Fig. 3b）。但是，與PBS處理組相比，LSC-Sec能夠顯著降低纖維化的嚴重程度（Fig. 3c, d）。二氧化硅誘導的結節(jié)周圍的纖維化組織強度較小且分布較廣，但在LSC-Sec和MSC-Sec處理組中均持續(xù)存在（Fig. 3c-f）。 與PBS處理相比，細胞分泌蛋白質組處理減少了膠原蛋白沉積并減少了肺泡上皮損傷，盡管膠原蛋白沉積仍顯著高于健康假對照組（Fig. 3f, g）。
對AQP5 + AT1細胞和ProSPC + AT2細胞的檢查顯示，在所有二氧化硅損傷的肺中，兩種肺泡標記物均無明顯下降（Fig. 3h-j）。但是，與PBS組相比，LSC-Sec能夠通過促進ProSPC + AT2細胞表達并維持AQP5 + AT1細胞群體來減少肺泡上皮損傷。表達AQP5的AT1細胞不存在纖維化結節(jié)，但ProSPC +和vWF +細胞的表達仍然有限（Fig. 3h-k）。
圖3二氧化硅損傷后小鼠肺的修復和纖維化
4、LSC分泌體和外泌體的蛋白質組成
為了更好的了解上述觀察到的LSC-Sec的再生能力的分子過程，作者嘗試構建它的蛋白組的組成。結果發(fā)現(xiàn)雖然這三株LSC細胞系來自不同性別、種族和年齡的個體(圖4a)，但卻具有非常相似的蛋白質組（Fig. 4a）。在共享的蛋白中，29.6%被標注為具有已知分泌膜受體的胞外蛋白，47.5%被標注為不存在已知分泌途徑的胞質蛋白（Fig. 4b）。在三個LSC-Sec中鑒定的103個細胞外蛋白中，有20個的相對豐度較高（Fig. 4c）。此外，在LSC-Sec中發(fā)現(xiàn)的102種常見細胞外蛋白中，約有一半也在LSC-Exo中發(fā)現(xiàn)（Fig. 4e）。Fig. 4d和Fig. 4f分別是LSC-Sec和LSC-Exo中鑒定的胞外蛋白的GO分析。
圖4 LSC-Sec和LSC-Exo的蛋白組分析
5、LSC外泌體的治療作用
通過大小、形態(tài)和常見的外泌體標記(CD63、CD81和TSG101)對LSC-Exo和MSC-Exo進行了表征（Fig. 5a-c）。所有分泌體和外泌體處理組均在維持正常肺結構（Fig. 5e-f）和減少纖維化（Fig. 5h）、肺凋亡和膠原沉積（Fig. 5j-i）方面均顯示出治療效果。值得注意的是，與PBS處理組相比，只有LSC-Sec和LSC-Exo顯著降低了膠原沉積。此外，只有LSC-Sec可顯著降低纖維化(Ashcroft評分)至與sham對照組相似的水平。治療組的肺αSMA蛋白含量沒表現(xiàn)明顯下降的趨勢（Fig. 5j）。LSC-Sec和LSC-Exo處理減緩了肺泡上皮和血管損傷，并降低纖維化反應，表現(xiàn)為AQP5 +和vWF +細胞增加和αSMA +細胞減少（Fig. 5k-n）。
圖5外泌體吸入處理肺纖維化大鼠的治療潛力
6、外泌體治療改善Bleo誘導后的肺功能
作者檢測發(fā)現(xiàn)MMP-2和MCP- 1的表達顯著響應LSC-Sec和LSC-Exo治療（Fig. 6a）。接下來，預測LSC-Sec和LSC-Exo治療受損肺結構和纖維化的臨床影響（Fig. 6b）。與預期一樣，吸氣量(IC)、阻力(Rrs)、順應性(Crs)、遲滯面積、用力呼氣容積(FEV)與用力肺活量(FVC)之比較基線均下降了（Fig. 6c-e, g, h），且呼吸彈性(Ers)，順應性的倒數(shù)，在中點分析時增加（Fig. 6f）?？傊蠦leo動物的肺功能持續(xù)受損，如預期的那樣，肺損傷，導致組織硬度和彈性反沖增加。
在終點分析中，通過分泌體和外泌體治療后僅部分恢復了肺功能。LSC-Sec，LSC-Exo或MSC-Exo治療后，吸氣能力和呼吸順應性均顯著改善（Fig. 6c-e）。僅使用LSC-Exo治療，呼吸阻力有明顯恢復（Fig. 6d）。治療后彈性，滯后面積和FEV / FVC比均無明顯變化。
圖6外泌體治療改善Bleo誘導后的肺功能和外泌體miRNA分析
7、LSC和MSC外泌體的microRNA分析
對LSC-Exo和MSC-Exo進行了小RNA深度測序，并分析了它們的miRNA組成的差異。在這些LSC-Exo和MSC-Exo樣本中，總共檢測到超過600種獨特的miRNA，這表明外源性miRNA在這些樣本中可能具有多種調控作用。除去豐度較少的miRNA后，仍有142個miRNA用于進行下游分析（Fig. 6i, j）。在兩種外泌體類型中總共發(fā)現(xiàn)42個差異表達的miRNAs。LSC-Exo中上調最多的miRNAs是hsa-miR- 99a-5p和hsa-miR-100-5p（Fig. 6j）。它們也是LSC-Exo中含量最高的兩個miRNAs，屬于miR-99家族（Fig. 6k）。
圖7外泌體治療改善Bleo誘導后的外泌體miRNA分析
總而言之，本文報告了新型脫細胞治療劑，即LSC-Sec和LSC-Exo，在嚙齒動物中博萊霉素誘導和二氧化硅誘導的肺纖維化治療中被證明是安全有效的。本文證明，LSC-Sec介導的再生機制可能與外泌體，MMP-2活性以及細胞分泌物中發(fā)現(xiàn)的大量蛋白質有關。分泌體和外泌體的免疫原性遠低于其親本，并且這些因子的施用可以克服干細胞的局限性，同時保持相似的治療效果。在LSC-Sec中對miR-30a和miR-99和let-7家族的miRNA的鑒定值得進一步研究，因為已知miR-30a在IPF患者以及miR-99和let-7家族中被下調。IPF目前是一種不可治愈的呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率和死亡率均在上升，目前沒有有效的療法，LSC-Sec和LSC-Exo為IPF療法的發(fā)展提供了新的希望。