PGC1α抑制肝癌轉(zhuǎn)移

    PPARγ協(xié)同激活因子-1α（PGC1α）是線粒體生物發(fā)生和呼吸的關(guān)鍵調(diào)控因子。PGC1α參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和代謝狀態(tài)。然而，其在肝細(xì)胞癌（HCC）進(jìn)展中的作用尚不清楚。今天小編為大家介紹發(fā)表于“Hepatology”的文章“PGC1α suppresses metastasis of HCC by inhibiting Warburg effect via PPARγ-dependent WNT/β-catenin/PDK1 axis”，帶大家了解其中的機(jī)制。

    在本研究中，我們觀察到PGC1α在人肝癌中下調(diào)。臨床研究表明，PGC1α的低表達(dá)與生存率低、血管侵犯和腫瘤體積大有關(guān)。PGC1α抑制肝癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的遷移和侵襲。PGC1α通過(guò)下調(diào)WNT/β-catenin途徑介導(dǎo)的PDK1而抑制Warburg效應(yīng)，PPARγ激活則抑制WNT/β-catenin途徑。
結(jié) 果：
1.PGC1α低表達(dá)與肝癌預(yù)后不良相關(guān)
    通過(guò)TCGA和GSE14520隊(duì)列分析，發(fā)現(xiàn)PGC1α在肝癌中下調(diào)（圖1A）。采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)肝癌組織及癌旁非癌組織中PGC1α的表達(dá)水平。如圖1B-C所示，與相應(yīng)的非腫瘤肝組織相比，腫瘤組織中PGC1α的mRNA水平降低了72.3%。western blot進(jìn)一步證實(shí)了PGC1α的下調(diào)（圖1D）。接著，為探討PGC1α在肝癌組織中下調(diào)的臨床意義，對(duì)肝癌患者的組織芯片進(jìn)行了免疫組化染色。PGC1α的代表性免疫染色如圖1E所示，根據(jù)免疫組化結(jié)果將肝癌患者分為兩組：PGC1α高表達(dá)組和PGC1α低表達(dá)組。Kaplan-Meier生存分析顯示，PGC1α表達(dá)水平低的肝癌患者總生存率（OS）和復(fù)發(fā)時(shí)間低于PGC1α水平高的患者（圖1F）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明PGC1α可能是預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后的一個(gè)有價(jià)值的因素。

2.PGC1α抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移
    為了探討PGC1α在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，我們建立了PGC1α在HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞系中高表達(dá)的穩(wěn)定模型，并根據(jù)PGC1α在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，建立了PGC1α在HepG2和SMMC7721細(xì)胞系中低表達(dá)的穩(wěn)定模型。遷移和侵襲試驗(yàn)表明，PGC1α的過(guò)表達(dá)顯著抑制了HCC細(xì)胞的遷移和侵襲性（圖2A-B），而PGC1α的敲除顯著促進(jìn)了HCC細(xì)胞的遷移和侵襲性（圖2C）。此外，為了在體內(nèi)證實(shí)上述發(fā)現(xiàn)，我們將穩(wěn)定的細(xì)胞株注入裸鼠的側(cè)尾靜脈，建立肺轉(zhuǎn)移模型。8周后，與對(duì)照組相比，注射PGC1α高表達(dá)HCCLM3細(xì)胞的小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較少（圖2D）。相反，PGC1α的敲除顯著增加了肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量（圖2E）。此外，與對(duì)照組相比，PGC1α的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)顯著降低了原位肝癌種植模型中肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量（圖2F）。相反，PGC1α敲除增加了肝內(nèi)和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量。這些結(jié)果提示PGC1α在體內(nèi)外均能抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，可能在肝癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起到抑癌作用。

3.PGC1α通過(guò)調(diào)節(jié)Warburg效應(yīng)抑制肝癌的進(jìn)展
    據(jù)報(bào)道，PGC1α在幾種癌癥的發(fā)展過(guò)程中參與了重編程代謝。我們假設(shè)肝癌細(xì)胞中PGC1α的抑瘤活性伴隨著一個(gè)整體的代謝重編程。我們比較了PGC1α高表達(dá)或基因敲除的肝癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞之間的關(guān)鍵細(xì)胞代謝和生物能量參數(shù)。結(jié)果表明，PGC1α的過(guò)表達(dá)顯著提高了HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧率和最大耗氧率（OCR），降低了細(xì)胞外酸化率（ECAR）（圖3A）。相反，PGC1α的敲除降低HepG2和SMMC7721細(xì)胞的OCR和ECAR（圖3B）。此外，PGC1α的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞ATP水平、葡萄糖攝取量的增加以及細(xì)胞外乳酸水平的降低（圖3C），而PGC1α的敲除降低了細(xì)胞內(nèi)ATP水平和葡萄糖攝取量，并增加了細(xì)胞外乳酸水平（圖3D）接著，為了探討Warburg效應(yīng)是否與HCC細(xì)胞的進(jìn)展有關(guān)，HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細(xì)胞分別用不同濃度的2-DG處理，結(jié)果顯示2-DG對(duì)HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細(xì)胞的糖酵解有明顯的抑制作用。HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細(xì)胞的遷移和侵襲能力也呈劑量依賴性下降（圖3E）。最后，為了進(jìn)一步探討PGC1α調(diào)節(jié)有氧糖酵解的機(jī)制，我們?cè)u(píng)估了PGC1α對(duì)重要糖酵解酶表達(dá)的影響。我們用RT-PCR檢測(cè)了13種糖酵解酶的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)除PDK1和乳酸脫氫酶（LDHA）外，大多數(shù)酶的表達(dá)水平?jīng)]有改變，PDK1的表達(dá)水平也基本改變（圖3F）。糖異生、氧化磷酸化和肝臟特異性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的標(biāo)記物也通過(guò)RT-PCR進(jìn)行測(cè)量（圖3G）。綜上所述，這些結(jié)果提示PDK1是PGC1α調(diào)節(jié)有氧糖酵解的功能下游靶點(diǎn)，對(duì)PGC1α介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要。

4.PGC1α對(duì)PDK1的抑制作用是由WNT/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的
    我們研究了PGC1α抑制PDK1的機(jī)制。通過(guò)RNA-seq評(píng)估HCCLM3細(xì)胞的整體基因表達(dá)模式（圖4A）。通過(guò)基因集富集分析（GSEA）研究轉(zhuǎn)錄組變化對(duì)生物功能和途徑的影響。我們發(fā)現(xiàn)WNT信號(hào)通路與HCCLM3細(xì)胞中的PGC1α顯著負(fù)相關(guān)（圖4B）。采用TOP/FOPFLASH報(bào)告分析PGC1α表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞WNT/β-catenin通路的影響。我們發(fā)現(xiàn)PGC1α的過(guò)表達(dá)顯著抑制了HCCLM3細(xì)胞中β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，而PGC1α敲除后HepG2細(xì)胞中TOPFLASH報(bào)告活性顯著增強(qiáng)（圖4B）。WNT/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)PDK1促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞有氧糖酵解。因此，我們?cè)赪NT/β-連環(huán)蛋白途徑抑制劑XAV-939或ICG-001存在下檢測(cè)PDK1和β-連環(huán)蛋白的水平。如圖4C和D所示，XAV-939或ICG-001逆轉(zhuǎn)了HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細(xì)胞中PDK1的mRNA和蛋白水平的升高。Pyruvate dehydrogenase（pSer293 PDH）作為PDK1的靶點(diǎn)，其升高水平也被WNT/β-catenin途徑抑制劑抑制。β-catenin蛋白水平隨著PGC1α的過(guò)表達(dá)而降低，隨著PGC1α的敲除而升高。因此，XAV-939和ICG-001均能抑制HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細(xì)胞ECAR和乳酸生成的增強(qiáng)水平（圖4E-4F）。這些數(shù)據(jù)表明PGC1α通過(guò)抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞PDK1的表達(dá)。

5.PPARγ對(duì)PGC1α誘導(dǎo)的WNT/β-catenin通路的抑制和肝癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)的影響
    PPARγ誘導(dǎo)典型WNT/β-catenin途徑的抑制，促進(jìn)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，我們探究PGC1α誘導(dǎo)的WNT/β-catenin信號(hào)抑制和抗Warburg效應(yīng)是否是通過(guò)PPARγ依賴方式介導(dǎo)的。雙熒光素酶報(bào)告分析顯示，PGC1α過(guò)表達(dá)的HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞中PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性顯著上調(diào)（圖5A）。采用TOP/FOPFLASH報(bào)告分析PPARγ對(duì)PGC1α過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞WNT/β-catenin通路的抑制作用。PPARγ基因敲除逆轉(zhuǎn)PGC1α誘導(dǎo)的WNT/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)抑制（圖5B）。這表明PGC1α對(duì)肝癌細(xì)胞WNT/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用依賴于PPARγ。
    接下來(lái)，我們探討PPARγ如何介導(dǎo)PGC1α誘導(dǎo)的肝癌WNT/β-catenin通路的抑制。結(jié)果表明，PGC1α即使在CHX存在的情況下也能降低β-catenin蛋白的水平（圖5C，左），表明β-catenin的衰減是一種翻譯后機(jī)制。然后，用蛋白酶體抑制劑MG-132處理HCCLM3細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)PGC1α介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白降解被MG-132拮抗（圖5C，右），這表明PGC1α介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白降解是由HCC細(xì)胞中的蛋白酶體介導(dǎo)的途徑引起的。此外，通過(guò)PPARγ基因敲除，PGC1α誘導(dǎo)的總β-連環(huán)蛋白和核β-連環(huán)蛋白下調(diào)被減弱（圖5D）。這表明PGC1α誘導(dǎo)β-catenin降解依賴于PPARγ。
    為了探討PGC1α誘導(dǎo)的抗Warburg作用是否依賴于肝癌細(xì)胞中的PPARγ，我們用PPARγ抑制劑GW9662治療肝癌細(xì)胞。如預(yù)期的那樣，GW9662逆轉(zhuǎn)了肝癌細(xì)胞中PGC1α過(guò)表達(dá)引起的ECAR下降（圖5E）。PPARγ的敲除逆轉(zhuǎn)了PGC1α介導(dǎo)的β-catenin、PDK1和pSer293 PDH的下調(diào)（圖5D），以及細(xì)胞外乳酸水平的降低（圖5F）。此外，PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮治療顯著抑制PGC1α基因敲除組在體內(nèi)外的腫瘤進(jìn)展（圖5G）。這些數(shù)據(jù)表明PPARγ通過(guò)增加β-catenin在肝癌細(xì)胞中的降解，介導(dǎo)PGC1α誘導(dǎo)的WNT/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)抑制和腫瘤進(jìn)展。

6.肝癌組織中PGC1α與PDK1呈負(fù)相關(guān)
    為了探討PDK1在HCC中的預(yù)后價(jià)值，我們分析了肝癌手術(shù)切除患者中PGC1α和PDK1的表達(dá)。肝細(xì)胞癌組織中PGC1α和PDK1的代表性照片如圖6A所示。PGC1α高表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織中PDK1的染色較弱，而PGC1α低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織中PDK1的染色較強(qiáng)。我們分析了肝癌組織中PGC1α表達(dá)與PDK1表達(dá)的關(guān)系。PGC1α表達(dá)與PDK1表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)（圖6B）。我們還分析了肝癌組織中PGC1α和PDK1表達(dá)水平的預(yù)后價(jià)值。Kaplan-Meier分析顯示PGC1α高表達(dá)和PDK1低表達(dá)的肝癌患者OS最高，復(fù)發(fā)率最低（圖6C）。這些結(jié)果提示PDK1在PGC1α介導(dǎo)的肝癌進(jìn)展中起作用。

結(jié) 論：
    我們研究了PGC1α在肝癌轉(zhuǎn)移和代謝中的作用及其機(jī)制。PGC1α通過(guò)抑制WNT/β-catenin途徑下游靶點(diǎn)PDK1的有氧糖酵解抑制肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移。PGC1α對(duì)WNT/β-catenin通路的抑制作用依賴于PPARγ。我們的發(fā)現(xiàn)闡明了PGC1α作用的新見解，并提示PGC1α可能是肝癌新治療策略的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。