強(qiáng)大的青蒿素 新興的鐵死亡 強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合發(fā)高分

    抗瘧藥物Artemisinin及其衍生物已被開發(fā)為潛在的抗癌藥物，但其抗癌的潛在機(jī)制仍存在爭議。本文旨在探究Artemisinin抗癌的新機(jī)制——鐵死亡。本文于2020年1月發(fā)表在《Cell death and differentiation》IF：10.717期刊上。
思路流程：

結(jié) 果：
1、ART及其衍生物使細(xì)胞對鐵死亡敏感
    ART化合物中內(nèi)過氧化物與生物鐵的反應(yīng)性使作者開始研究這些化合物是否能調(diào)節(jié)鐵死亡，一種鐵依賴的細(xì)胞死亡方式。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)和人類骨肉瘤HT1080細(xì)胞中，作者發(fā)現(xiàn)多種ART化合物（圖1A）。并且所有ART化合物均以時(shí)間和劑量依賴的方式使細(xì)胞對半胱氨酸饑餓(STV)誘導(dǎo)的鐵死亡敏感(圖1B,C)。作為所有ART化合物的活性代謝物，DAT對STV誘導(dǎo)的鐵蛋白作用最敏感。因此，作者著重探究DAT對鐵死亡的作用。對于erastin和RSL3，細(xì)胞死亡的強(qiáng)度與脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生相關(guān)(圖1E)，證實(shí)了觀察到的細(xì)胞死亡是鐵死亡。隨后，我們研究了DAT致敏鐵蛋白作用的分子基礎(chǔ)。

圖1Artemisinin及其衍生物使細(xì)胞對鐵死亡敏感

2、DAT增加細(xì)胞游離鐵含量，但對細(xì)胞谷胱甘肽無影響
    鐵死亡是鐵依賴的細(xì)胞死亡方式，因此探究了DAT是否影響細(xì)胞內(nèi)GSH和鐵的水平。如所示，Erastin誘導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞GSH水平顯著下降(圖2a)，然而，DAT本身或存在erastin時(shí)對細(xì)胞GSH水平?jīng)]有影響(圖2a)。另一方面，無論是單獨(dú)使用還是與erastin結(jié)合，DAT都導(dǎo)致了細(xì)胞中游離鐵含量的增加，鐵含量被量化為細(xì)胞LIP(圖2b)。如預(yù)期的，鐵螯合劑去鐵胺(DFO)完全抑制了由erastin單獨(dú)或與DAT聯(lián)合引起的鐵螯作用(圖2c)。這表明，DAT對鐵死亡致敏作用的影響是由于細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵含量的增加，而不是細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平的增加。

圖2 DAT增加細(xì)胞游離鐵含量，但對細(xì)胞谷胱甘肽無影響

3、DAT對鐵死亡的影響不依賴自噬
    此前有報(bào)道，自噬通過降解細(xì)胞內(nèi)鐵儲存蛋白的鐵蛋白，增加細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵的含量，從而促進(jìn)鐵死亡。有趣的是，ART已經(jīng)被證明可以刺激自噬，鑒于這些研究以及上述結(jié)果中DAT可以促進(jìn)細(xì)胞對鐵死亡的敏感，因此，作者進(jìn)一步探究DAT是否通過自噬依賴的方式促進(jìn)鐵死亡。
    結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1(bafA1)進(jìn)一步增加了LC3-II的產(chǎn)量和GFP-LC3斑點(diǎn)的形成，但阻止了p62的降解(圖3a, b)。然而，無論是單獨(dú)使用還是與erastin聯(lián)合使用(圖3a, b)，當(dāng)濃度為10μM時(shí)，DAT均未引起自噬通量的增加，而該濃度下DAT可以顯著增加細(xì)胞對鐵死亡的敏感（圖1）。隨后在自噬必需基因Atg5基因敲除(Atg5- ko)實(shí)驗(yàn)中得出了類似的結(jié)果。因此，上述表明DAT對鐵死亡的影響是一種非自噬依賴的方式。

圖3 DAT不影響自噬通量，并通過一種不依賴自噬的機(jī)制使細(xì)胞對鐵死亡敏感

4、溶酶體活性對于DAT敏感的非自噬依賴的鐵死亡是必需的
    與DAT在鐵死亡中的自噬獨(dú)立作用一致的是，在自噬缺陷MEFs (Atg5-KO)中，DAT增加了Atg5-KO 的LIP，而erastin僅增加了自噬補(bǔ)充MEFs的LIP (圖4a)。有趣的是，在自噬狀態(tài)和自噬缺陷狀態(tài)下，溶酶體抑制劑BafA1抑制了由erastin和DAT引起的LIP的增加(圖4a)。此外，無論是自噬狀態(tài)的MEFs還是自噬缺陷的MEFs， BafA1都抑制了erastin單獨(dú)或與DAT聯(lián)合誘導(dǎo)的鐵蛋白作用(圖4b)。
隨后，作者研究了erastin和DAT單獨(dú)或聯(lián)合作用對細(xì)胞鐵蛋白水平及其自噬貨物受體Ncoa4的影響。在自噬補(bǔ)充的MEFs中，erastin刺激了Ncoa4水平的溶酶體降解，而BafA1阻止了Ncoa4水平的降解，而細(xì)胞中的鐵蛋白水平?jīng)]有被erastin顯著改變(圖4c)。另一方面，DAT誘導(dǎo)溶酶體降解的鐵蛋白同時(shí)發(fā)生在自噬補(bǔ)充和自噬缺陷的MEF中，而DAT對鐵蛋白的影響與溶酶體的Ncoa4降解無關(guān)(圖4 c)，表明DAT可以誘導(dǎo)鐵蛋白溶酶體降解，使細(xì)胞游離鐵濃度增加，從而使細(xì)胞對鐵死亡敏感，以自噬和Ncoa4非依賴的方式。

圖4溶酶體活性對于DAT敏感的非自噬依賴的鐵死亡是必需的

5、DAT通過IRP-IRE信號調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)
    據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IRP和IRE是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵含量的重要蛋白，因此，為了定量測量DAT和erastin對IRP-IRE信號通路的潛在影響，使用了兩個(gè)報(bào)告質(zhì)粒，如圖5a所示，探究IRE/IRP相互作用和erastin或DAT對鐵蛋白翻譯調(diào)控。其中一個(gè)質(zhì)粒以熒光素酶為讀出器(5 IRE-Luc- IRES-GFP)，另一個(gè)質(zhì)粒以mCherry為讀出器(5 IRE-mCherry-IRES-GFP)。
    如圖5b所示，在具有穩(wěn)定熒光素酶報(bào)告基因的MEFs中，DAT處理降低了熒光素酶/GFP比率，而erastin處理提高了Luc/GFP比率；DAT處理后mCherry的熒光比率也有一致地變化趨勢。觀察到的erastin對IRP-IRE信號傳導(dǎo)的影響的分子基礎(chǔ)(圖5b, c)大體如下：通過刺激自噬溶酶體降解鐵蛋白，erastin導(dǎo)致LIP的增加，進(jìn)而降低IRP-IRE的親和力，導(dǎo)致鐵蛋白合成的增加。隨后體外監(jiān)測MDA生成過程，這是一種由亞鐵離子和抗壞血酸催化的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(圖5d)。如圖5e所示，DAT雖然足以與反應(yīng)體系中的所有亞鐵離子復(fù)合，但并不抑制脂質(zhì)過氧化。因此，與DAT相關(guān)的鐵維持催化超氧化反應(yīng)的能力，就像自由亞鐵離子一樣。

圖5 DAT通過IRP-IRE信號調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)

6、DAT使癌細(xì)胞對鐵死亡敏感，具有治療作用
    考慮到DAT能使細(xì)胞對GPX4抑制劑RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡敏感，作者進(jìn)一步測試DAT是否能使這些原本對鐵死亡耐藥的癌細(xì)胞對GPX4的抑制更敏感。如圖6a所示，使用不同濃度的RSL3處理不同類型腫瘤來源的細(xì)胞系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對RSL3敏感的MEFs和HT1080細(xì)胞相比，本試驗(yàn)中RSL濃度最高時(shí)，誘導(dǎo)這些癌細(xì)胞的鐵死亡和脂質(zhì)過氧化作用也大大降低(圖6a)。重要的是，DAT以鐵死亡敏感的方式顯著提高了這些細(xì)胞對RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化的敏感性(圖6b, c)。
    為了進(jìn)一步研究該結(jié)論，進(jìn)行小鼠體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)。人H292肺癌細(xì)胞，對GPX4抑制抵抗，以Dox誘導(dǎo)的方式介導(dǎo)CRISPR/Cas9-介導(dǎo)的H292肺癌細(xì)胞GPX4敲除(圖6a)。Western blot證實(shí)Dox處理后H292細(xì)胞中GPX4敲除的效率(圖6d)。如預(yù)期的，當(dāng)GPX4被敲除時(shí)，細(xì)胞死亡和脂質(zhì)ROS生成水平較低，而這兩者都被DAT以鐵死亡敏感的方式增強(qiáng)(圖6d)。隨后，通過皮下接種含有可誘導(dǎo)GPX4敲除的H292細(xì)胞的裸鼠進(jìn)行了體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)。如圖6e g所示，喂食Dox飼料的小鼠腫瘤中GPX4的表達(dá)顯著降低。與對照組小鼠(-Dox-DAT)相比，服用Dox或單獨(dú)服用DAT的小鼠腫瘤生長略有下降。綜上所述，這些結(jié)果表明DAT可用于提高GPX4靶向治療的效果，特別是對GPX4抑制耐藥的腫瘤。

圖6在體內(nèi)和體外，DAT增加脂質(zhì)ROS，使癌細(xì)胞對鐵死亡作用敏感

    總之，相對低劑量的鐵死亡誘導(dǎo)劑，有望能被正常組織接受，并可能對這些癌癥的治療有效。施用DAT使癌細(xì)胞對鐵死亡進(jìn)一步敏感，可縮短治療時(shí)間，提高療效。上述發(fā)現(xiàn)可用于臨床，以增強(qiáng)未來鐵死亡誘導(dǎo)癌癥治療的效果，為今后腫瘤臨床治療提供新的策略。
參考文獻(xiàn)：
Chen Guo-Qing., Benthani Fahad A., Wu Jiao., Liang Deguang., Bian Zhao-Xiang., Jiang Xuejun.(2020). Artemisinin compounds sensitize cancer cells to ferroptosis by regulating iron homeostasis. Cell Death Differ., 27(1), 242-254. doi:10.1038/s41418-019-0352-3