Mydgf促進心肌細胞增殖和新生心臟再生

    骨髓源性生長因子（Mydgf）是一種由骨髓源性單核細胞和巨噬細胞分泌的旁分泌蛋白，在成年小鼠心肌梗死（MI）后具有抗心肌損傷的作用。因此小編為大家介紹發(fā)表于“Theranostics”雜志的文章“Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration”，給大家介紹Mydgf與心臟再生。

    在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)心肌損傷后，Mydgf在新生小鼠心臟中被顯著誘導(dǎo)。Mydgf缺乏阻礙心肌細胞（CM）增殖和心臟再生。Mydgf重組蛋白對CM的體內(nèi)外增殖均有促進作用。RNA測序鑒定c-Myc/FoxM1通路介導(dǎo)Mydgf的促增殖作用。Mydgf治療可促進心肌梗死后成年小鼠CM增殖和心臟再生，提示Mydgf可能是心肌損傷恢復(fù)的有效再生因子。
結(jié) 果：
1.Mydgf是在新生心臟再生過程中被誘導(dǎo)的
    我們采用qRT-PCR和western-blot檢測野生型小鼠出生后心臟發(fā)育過程中Mydgf的表達。我們發(fā)現(xiàn)Mydgf在出生后第4天（P4）略有增加，然后隨著年齡的增長逐漸降低（圖1A-D）。為了研究Mydgf是否參與了新生心臟再生，我們對P1心臟進行了根尖切除術(shù)（AR），并測量了Mydgf在切除后不同時間點的表達（圖1E）。Western blot和qRT-PCR顯示，Mydgf表達在切除后1、4、7、14和21天顯著增加（圖1F-H）。接著，為了確定心臟再生過程中產(chǎn)生Mydgf的細胞類型，我們在AR后使用流式細胞術(shù)對巨噬細胞（MΦs）、CMs和內(nèi)皮細胞（ECs）進行分類，并通過qRT-PCR驗證三個細胞群的純度。我們發(fā)現(xiàn)，在1dpr時，Mydgf主要由ECs而不是MΦs表達（圖1I）。此外，我們還構(gòu)建了Mydgf-EGFP小鼠，包括連接體EGFP和左（1302bp）和右（1765bp）2條同源臂，以研究Mydgf的合成。免疫組化顯示EGFP與CDH5+細胞共定位，CDH5+細胞是ECs在7dpr時的標(biāo)記，提示ECs是新生兒心臟損傷后的主要細胞類型（圖1J）。

2.Mydgf是心臟再生和CM增殖所必需的
    我們對P1-Mydgf-KO小鼠進行了AR，并評估了心臟再生。Masson染色分析顯示，與WT小鼠相比，Mydgf KO小鼠在21 dpr時的纖維化顯著增大，再生能力顯著降低（圖2A-B）。超聲心動圖顯示，與WT小鼠相比，Mydgf KO小鼠在21 dpr時心臟功能更差（圖2C-D），表明Mydgf是心臟再生所必需的。心臟再生反應(yīng)的中心特征是損傷后CM增殖的激活。我們在P1 Mydgf-KO小鼠上進行AR手術(shù)，并在7 dpr時，通過免疫熒光檢測有絲分裂標(biāo)記物磷酸化組蛋白3（pH3）、Ki67和Aurora B（Aurkb）（圖2E）。我們發(fā)現(xiàn)Mydgf缺乏對AR損傷后CM的增殖是有害的（圖2F-K）。最后，我們用共焦顯微鏡測定了CM倍體，這使得單個CM細胞核中DNA含量的定量成為可能（圖2L）。以非CMs作為二倍體（2N）細胞核的參照物，Mydgf-KO-CM細胞核在14 dpr的雙核CMs中2N核減少了40%，多倍體（4N和>4N）增加了30%（圖2M），表明Mydgf缺乏減少了核分裂，從而增加了倍性。

3.Mydgf足以促進CM增殖和心臟再生
    為了研究Mydgf是否能刺激CM增殖，我們從WT小鼠中分離出新生的原發(fā)性CMs，并用Mydgf重組蛋白處理（圖3A）。免疫熒光染色顯示，與PBS組相比，Mydgf處理的CMs在16小時后pH3+、Ki67+和Aurkb+CMs顯著增加（圖3B-G），表明Mydgf促進CM體外增殖。
    我們將Mydgf重組蛋白微注射到Mydgf- KO P1小鼠AR損傷后的心肌中（圖3H）。Masson染色和超聲心動圖分析表明，用Mydgf處理的Mydgf- KO小鼠表現(xiàn)出完全的心臟再生（圖3I-J）和收縮功能障礙的增強（圖3K-L）。我們還通過免疫熒光染色檢測7dpr處CM增殖，發(fā)現(xiàn)在7dpr時CM增殖顯著增強（圖3M-R）。這些結(jié)果表明，Mydgf能促進CM的體內(nèi)增殖，促進心臟損傷后新生心臟的再生。

4.Mydgf通過c-Myc/FoxM1途徑控制CM增殖
    我們利用RNA測序研究了Mydgf處理的新生小鼠的基因表達譜（圖4A），發(fā)現(xiàn)在Mydgf治療16小時后，共有1005個基因差異表達，包括298個下調(diào)基因和707個上調(diào)基因。通過KEGG對上調(diào)基因的分析顯示細胞周期和PI3K-Akt信號通路的顯著富集。Western blot顯示Mydgf處理的CMs中細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、CDK1和CDK6以及Akt（Ser473）的磷酸化（p）明顯增加（圖4B）。Mydgf-和PBS處理的CMs之間的細胞周期基因熱圖如圖4C所示。我們發(fā)現(xiàn)Mydgf處理的CMs中FoxM1和Myc顯著增加（圖4D）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)對照組相比，在4和7dpr時，野生型小鼠心肌中的c-Myc和FoxM1均增加（圖4E）。最后，我們還對新生的Mydgf-KO和WT小鼠進行了AR手術(shù)。Western blot顯示，Mydgf缺乏可降低4 dpr和7 dpr的p-Akt、c-Myc和FoxM1的表達（圖4F），表明c-Myc和FoxM1在心臟再生中不可或缺。
    FoxM1和c-Myc都被確定為促增殖因子。我們發(fā)現(xiàn)，Mydgf誘導(dǎo)的CM增殖分別通過敲除Akt、c-Myc或FoxM1（圖4G-L）而顯著抑制。Western blot顯示Akt抑制劑LY294002、siRNA-c-Myc和siRNA-FoxM1可以抑制Mydgf誘導(dǎo)的p-Akt、Cyclin B1、Cyclin D1和CDK1的激活（圖4M）。我們還發(fā)現(xiàn)，Akt敲除抑制了c-Myc和FoxM1的表達，而c-Myc的敲除阻斷了FoxM1的表達，而FoxM1的敲除對Akt和c-Myc沒有影響（圖4M），表明Akt介導(dǎo)的Mydgf通過c-Myc/FoxM1途徑誘導(dǎo)CM增殖。

5.Mydgf促進成年小鼠心臟再生
    為了驗證Mydgf在成年小鼠中的功能，我們建立了心肌梗死（MI）小鼠模型。我們將Mydgf重組蛋白微量注射到心肌梗死后的WT成年小鼠心臟中，然后連續(xù)尾靜脈注射7天（圖5A）。Masson染色和超聲心動圖分析顯示，在21 dpi時，Mydgf處理的心臟顯示梗死面積減小（圖5B-C），并且出現(xiàn)不太明顯的收縮功能障礙（圖5D-E）。Mydgf處理的小鼠與顯著的生存效益相關(guān)（圖5F）。免疫熒光染色顯示Mydgf處理的小鼠在7dpi時CM增殖增加（圖5G-L）。這些結(jié)果表明，Mydgf可促進成年小鼠心肌梗死后心臟再生和CM增殖，提示Mydgf可能是逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)和預(yù)防心力衰竭的有效靶點。

結(jié) 論：
    Mydgf通過激活c-Myc/FoxM1通路促進心肌細胞增殖，促進新生和成年小鼠心臟損傷后的心臟再生，為逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)和心力衰竭提供了一個潛在的靶點。