膽道梗阻——腫瘤細(xì)胞微泡幫你來(lái)疏通

        膽管癌（CCA）是一種上皮惡性腫瘤，其5年生存率極低。其中90％以上的CCA來(lái)自肝外膽管，容易形成惡性膽道梗阻。手術(shù)切除肝外CCA（ECCA）的復(fù)發(fā)率仍然很高，目前的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法或放射療法并未提高生存率。目前，膽道引流已成為不可切除患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。這種治療可以使膽紅素水平正常化，從而提高整體生存率。然而，由于諸如支架遷移、支架阻塞，腫瘤向內(nèi)生長(zhǎng)、感染和膽管炎等并發(fā)癥，長(zhǎng)期膽道引流仍然具有挑戰(zhàn)性?；谥委烢CCA的這些困難，研究治療策略至關(guān)重要。2020年7月6日，來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院黃波、劉玉英、天津醫(yī)科大學(xué)王西墨等人合作在Nature Biomedical Engineering雜志上發(fā)表了一篇文章“Methotrexate-loaded tumour-cell-derived microvesicles can relieve biliary obstruction in patients with extrahepatic cholangiocarcinoma.”（影響因子18.952），該研究報(bào)道了甲氨蝶呤負(fù)載的腫瘤細(xì)胞微泡可緩解肝外膽管癌患者的膽道梗阻。

結(jié) 果:
一、MTX–TMP灌注可有效治療阻塞性CCA
        首先對(duì)患有惡性膽道梗阻的晚期ECCA（n = 20）患者進(jìn)行經(jīng)皮肝穿刺膽道引流術(shù)（PTBD），然后將負(fù)載甲氨蝶呤（MTX）的TMP（MTX–TMPs）（20ml含有6×107 MPs和120μgMTX）注入腫瘤上方的膽管腔質(zhì)量，然后關(guān)閉2小時(shí)的管，這使MTX–TMP發(fā)揮作用。然后，作者打開(kāi)導(dǎo)管并收集膽道引流。根據(jù)糞便顏色的變化，膽管造影顯示20例患者中有5例梗阻得到緩解（圖1a）。此外，在治療后，阻塞緩解可能會(huì)持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。例如，一名患者接受MTX-TMP治療后，膽管梗阻可緩解長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月（圖1b）。這些結(jié)果表明，MTX-TMPs可用于治療患有膽道梗阻的ECCA患者。

二、MTX–TMP灌注吸引中性粒細(xì)胞
        接下來(lái)，作者研究了MTX-TMP灌注治療阻塞性CCA的潛在機(jī)制。HE染色顯示腫瘤周?chē)?xì)胞外基質(zhì)和基底膜的密度很高（圖2a）。重點(diǎn)是，腫瘤組織可以被膠原酶溶解，導(dǎo)致CD45-腫瘤細(xì)胞的釋放。但是，TMP或MTX-TMP與腫瘤組織的孵育沒(méi)有相似的效果（圖2b），這表明TMP本身可能不會(huì)直接降解基質(zhì)。因此，可能會(huì)響應(yīng)MTX-TMPs釋放特定因子，這可能會(huì)破壞基質(zhì)結(jié)構(gòu)并允許TMP獲得進(jìn)入CCA細(xì)胞的通道。對(duì)膽汁引流年齡的流式細(xì)胞儀分析表明，治療前CCA患者的膽汁中存在少量免疫細(xì)胞，但是MTX-TMP灌注顯著增加了膽管中免疫細(xì)胞的數(shù)量（圖2c）。大多數(shù)其他免疫細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞，有一些巨噬細(xì)胞，但很少有T細(xì)胞，B細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞（圖2d，e）。值得注意的是，在引流（圖2f，g）中檢測(cè)到了中性粒細(xì)胞相關(guān)的組織降解酶彈性蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶8（MMP8）。這些酶在引流中的水平與其他中性粒細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)（圖2h，i）。這些結(jié)果表明，MTX-TMP灌注有效地將中性粒細(xì)胞募集到膽汁中，在那里它們釋放彈性蛋白酶和MMP8，從而削弱了基質(zhì)屏障并允許MTX-TMP獲得進(jìn)入CCA細(xì)胞的通道。

三、中性粒細(xì)胞被MTX–TMP中的UDPG和C5直接吸引
        接下來(lái)，作者研究了中性粒細(xì)胞在MTX–TMP灌注過(guò)程中如何被膽汁吸引。Transwell測(cè)定發(fā)現(xiàn)MTX–TMP能夠吸引中性粒細(xì)胞從上腔室遷移至下腔室（圖3a，b），這表明MTX–TMPs能夠募集中性粒細(xì)胞。當(dāng)UDPG注入U(xiǎn)DPG時(shí)引起中性粒細(xì)胞積累小鼠腹膜腔（圖3d，e）。 Transwell分析還顯示UDPG吸引了中性粒細(xì)胞（補(bǔ)充圖3g）。在TMP，MTX–TMP或其他藥物–TMP中無(wú)法檢測(cè)到UTP水平。因此，增加的UDPG可能不是由于MTX治療的HL-60腫瘤細(xì)胞中UTP增加。作者觀察到，MTX處理顯著上調(diào)了參與糖原合成的酶的表達(dá)，導(dǎo)致HL中糖原和UDPG的水平增加-60個(gè)細(xì)胞（圖3f）。來(lái)自UGP2-/-HL-60細(xì)胞的MTX-TMPs中性粒細(xì)胞吸引力顯著降低（圖3i），這表明UDPG的存在使中性粒細(xì)胞被MTX-TMP吸引。  C5a是一種ana phylatoxin，可以吸引粒細(xì)胞。與其他藥物相比，MTX處理可顯著增加HL-60細(xì)胞和衍生的TMP中C5的表達(dá)（圖3j）。C5組合式減弱了MTX-TMP介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞吸引力（圖3k）。作者還發(fā)現(xiàn)，源自C5或UDPG缺陷的HL-60細(xì)胞的MTX–TMPs幾乎完全喪失了吸引中性粒細(xì)胞的能力（圖3k），這表明中性粒細(xì)胞的吸引力是依賴(lài)的在C5和UDPG上。重要的是，在MTX-TMP灌注后，作者觀察到患者膽汁引流中UDPG和C5濃度增加（圖3l）?？傊琈TX-TMP灌注能夠通過(guò)UDPG和C5依賴(lài)性途徑吸引嗜中性粒細(xì)胞。

四、MTX–TMPs誘導(dǎo)CCA細(xì)胞凋亡
        流式細(xì)胞儀和H＆E染色分析了五名患者的引流膽汁中的腫瘤細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)MTX–TMP灌注以時(shí)間依賴(lài)性方式導(dǎo)致CD45?腫瘤細(xì)胞死亡（圖4a）。灌注之前，約有1.8％的CD45-腫瘤細(xì)胞死亡。然而，治療后，死亡的腫瘤細(xì)胞的平均比例分別在4h后增加到9％，在24h和48h之后分別增加到20％和25％（圖4a）。為了驗(yàn)證MTX–TMP殺死CCA細(xì)胞的能力，作者在體外將MTX–TMP與CCA細(xì)胞一起孵育。結(jié)果表明，只有MTX–TMP，而不是單獨(dú)使用藥物或不含藥物的TMP，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用（圖4b，c）。MTX-TMP介導(dǎo)的細(xì)胞毒性似乎誘導(dǎo)了壞死樣的形態(tài)改變，這是由垂死的細(xì)胞與質(zhì)膜上的特征性大氣泡腫脹所證實(shí)的（圖4c）。大量的胞質(zhì)成分乳酸脫氫酶（LDH）被釋放到上清液中（圖4d），表明程序性壞死細(xì)胞死亡。蛋白質(zhì)印跡分析表明，MTX-TMP處理的人RBE CCA細(xì)胞均未激活MLKL和GSDMD。然而，GSDME被顯著激活（圖4e）。更重要的是，發(fā)現(xiàn)從PDX小鼠模型中分離出的人類(lèi)原代CCA細(xì)胞表達(dá)高水平的GSDME，MTX-TMP處理導(dǎo)致活性GSDME的產(chǎn)生（圖4g）。與CCA細(xì)胞凋亡一致，作者還發(fā)現(xiàn)5例患者在MTX–TMP灌注后引流中LDH水平升高（圖4h）?？傊?，通過(guò)GSDME途徑進(jìn)入腫瘤的MTX-TMP觸發(fā)了CCA細(xì)胞的熱凋亡。

五、MTX–TMP灌注觸發(fā)了第二次招募中性粒細(xì)胞的浪潮
        作者假設(shè)，MTX-TMP介導(dǎo)的焦細(xì)胞凋亡觸發(fā)了中性粒細(xì)胞向膽管遷移的第二波。經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，來(lái)自焦光CCA細(xì)胞的上清液可以有效吸引中性粒細(xì)胞（圖5a）。并且用焦磷酸化CCA細(xì)胞上清液處理的巨噬細(xì)胞不僅上調(diào)了IL-6和CCL2，而且還產(chǎn)生了嗜中性粒細(xì)胞引誘劑腫瘤壞死因子（TNF），IL-1β，CCL3，CCL20和CXCL5（圖5b）。巨噬細(xì)胞的上清液能夠有效地吸引嗜中性粒細(xì)胞（圖5c），這表明經(jīng)熱解刺激的巨噬細(xì)胞具有吸引中性粒細(xì)胞的能力。MTX–TMP處理過(guò)的人類(lèi)單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞還產(chǎn)生了多種細(xì)胞因子，例如IL-6，CCL2，CCL3，CCL20和中性粒細(xì)胞引誘劑CXCL1，CXCL5和TNF（圖5d）。此外，兩種吸引巨噬細(xì)胞的化學(xué)因子CCL2和CCL3以及一種天然的吸引T細(xì)胞的趨化因子CCL20在引流中也升高了（圖5e）?？傊?，在MTX-TMP灌注后，UDPG對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生了最初的吸引力之后，出現(xiàn)了第二次中性粒細(xì)胞募集的浪潮。

六、MTX–TMP灌注誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞顯示出抗腫瘤表型
        為了闡明募集的中性粒細(xì)胞在膽管中的作用，作者從患者中分離了中性粒細(xì)胞，并將其與CCA細(xì)胞孵育。作者發(fā)現(xiàn)這些中性粒細(xì)胞具有殺死腫瘤細(xì)胞的能力（圖6a）。在MTX-TMP灌注后，膽汁中性粒細(xì)胞和膽汁引流年齡發(fā)現(xiàn)活性氧ROS和NO水平升高（圖6b，c）。作者檢查了MTX-TMP對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)處理過(guò)的細(xì)胞具有殺死CCA細(xì)胞的能力（圖6d），同時(shí)伴隨著ROS水平的升高（圖6e）。此外，作者發(fā)現(xiàn)，MTX-TMP處理過(guò)的RBE細(xì)胞的焦上清液還賦予嗜中性粒細(xì)胞殺死CCA細(xì)胞的能力，并增加了ROS水平（圖6f，g）?？傊?，MTX-TMP灌注觸發(fā)了多種途徑，這些途徑將膽汁浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞引導(dǎo)至抗腫瘤表型。

結(jié) 論:
        這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，含有MTX的MTP通過(guò)動(dòng)員和激活中性粒細(xì)胞，可以作為一種免疫治療劑，有效治療阻塞性ECCA。 與不攻擊腫瘤細(xì)胞的常規(guī)靶向嗜中性白細(xì)胞的免疫治療劑（例如Coley毒素和卡介苗桿菌Calmette-Guérin免疫療法）不同，MTX-TMP也能夠直接殺死腫瘤細(xì)胞。 更重要的是，這種殺傷作用可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生熱解性死亡，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥信號(hào)，從而壓倒腫瘤的威壓并賦予腫瘤浸潤(rùn)性嗜中性粒細(xì)胞以抗腫瘤表型。