膽管癌(CCA)是一種上皮惡性腫瘤,其5年生存率極低。其中90%以上的CCA來自肝外膽管,容易形成惡性膽道梗阻。手術(shù)切除肝外CCA(ECCA)的復(fù)發(fā)率仍然很高,目前的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法或放射療法并未提高生存率。目前,膽道引流已成為不可切除患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。這種治療可以使膽紅素水平正?;瑥亩岣哒w生存率。然而,由于諸如支架遷移、支架阻塞,腫瘤向內(nèi)生長(zhǎng)、感染和膽管炎等并發(fā)癥,長(zhǎng)期膽道引流仍然具有挑戰(zhàn)性?;谥委烢CCA的這些困難,研究治療策略至關(guān)重要。2020年7月6日,來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院黃波、劉玉英、天津醫(yī)科大學(xué)王西墨等人合作在Nature Biomedical Engineering雜志上發(fā)表了一篇文章“Methotrexate-loaded tumour-cell-derived microvesicles can relieve biliary obstruction in patients with extrahepatic cholangiocarcinoma.”(影響因子18.952),該研究報(bào)道了甲氨蝶呤負(fù)載的腫瘤細(xì)胞微泡可緩解肝外膽管癌患者的膽道梗阻。
結(jié) 果:
一、MTX–TMP灌注可有效治療阻塞性CCA
首先對(duì)患有惡性膽道梗阻的晚期ECCA(n = 20)患者進(jìn)行經(jīng)皮肝穿刺膽道引流術(shù)(PTBD),然后將負(fù)載甲氨蝶呤(MTX)的TMP(MTX–TMPs)(20ml含有6×107 MPs和120μgMTX)注入腫瘤上方的膽管腔質(zhì)量,然后關(guān)閉2小時(shí)的管,這使MTX–TMP發(fā)揮作用。然后,作者打開導(dǎo)管并收集膽道引流。根據(jù)糞便顏色的變化,膽管造影顯示20例患者中有5例梗阻得到緩解(圖1a)。此外,在治療后,阻塞緩解可能會(huì)持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。例如,一名患者接受MTX-TMP治療后,膽管梗阻可緩解長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月(圖1b)。這些結(jié)果表明,MTX-TMPs可用于治療患有膽道梗阻的ECCA患者。
二、MTX–TMP灌注吸引中性粒細(xì)胞
接下來,作者研究了MTX-TMP灌注治療阻塞性CCA的潛在機(jī)制。HE染色顯示腫瘤周圍細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的密度很高(圖2a)。重點(diǎn)是,腫瘤組織可以被膠原酶溶解,導(dǎo)致CD45-腫瘤細(xì)胞的釋放。但是,TMP或MTX-TMP與腫瘤組織的孵育沒有相似的效果(圖2b),這表明TMP本身可能不會(huì)直接降解基質(zhì)。因此,可能會(huì)響應(yīng)MTX-TMPs釋放特定因子,這可能會(huì)破壞基質(zhì)結(jié)構(gòu)并允許TMP獲得進(jìn)入CCA細(xì)胞的通道。對(duì)膽汁引流年齡的流式細(xì)胞儀分析表明,治療前CCA患者的膽汁中存在少量免疫細(xì)胞,但是MTX-TMP灌注顯著增加了膽管中免疫細(xì)胞的數(shù)量(圖2c)。大多數(shù)其他免疫細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞,有一些巨噬細(xì)胞,但很少有T細(xì)胞,B細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞(圖2d,e)。值得注意的是,在引流(圖2f,g)中檢測(cè)到了中性粒細(xì)胞相關(guān)的組織降解酶彈性蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶8(MMP8)。這些酶在引流中的水平與其他中性粒細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)(圖2h,i)。這些結(jié)果表明,MTX-TMP灌注有效地將中性粒細(xì)胞募集到膽汁中,在那里它們釋放彈性蛋白酶和MMP8,從而削弱了基質(zhì)屏障并允許MTX-TMP獲得進(jìn)入CCA細(xì)胞的通道。
三、中性粒細(xì)胞被MTX–TMP中的UDPG和C5直接吸引
接下來,作者研究了中性粒細(xì)胞在MTX–TMP灌注過程中如何被膽汁吸引。Transwell測(cè)定發(fā)現(xiàn)MTX–TMP能夠吸引中性粒細(xì)胞從上腔室遷移至下腔室(圖3a,b),這表明MTX–TMPs能夠募集中性粒細(xì)胞。當(dāng)UDPG注入U(xiǎn)DPG時(shí)引起中性粒細(xì)胞積累小鼠腹膜腔(圖3d,e)。 Transwell分析還顯示UDPG吸引了中性粒細(xì)胞(補(bǔ)充圖3g)。在TMP,MTX–TMP或其他藥物–TMP中無法檢測(cè)到UTP水平。因此,增加的UDPG可能不是由于MTX治療的HL-60腫瘤細(xì)胞中UTP增加。作者觀察到,MTX處理顯著上調(diào)了參與糖原合成的酶的表達(dá),導(dǎo)致HL中糖原和UDPG的水平增加-60個(gè)細(xì)胞(圖3f)。來自UGP2-/-HL-60細(xì)胞的MTX-TMPs中性粒細(xì)胞吸引力顯著降低(圖3i),這表明UDPG的存在使中性粒細(xì)胞被MTX-TMP吸引。 C5a是一種ana phylatoxin,可以吸引粒細(xì)胞。與其他藥物相比,MTX處理可顯著增加HL-60細(xì)胞和衍生的TMP中C5的表達(dá)(圖3j)。C5組合式減弱了MTX-TMP介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞吸引力(圖3k)。作者還發(fā)現(xiàn),源自C5或UDPG缺陷的HL-60細(xì)胞的MTX–TMPs幾乎完全喪失了吸引中性粒細(xì)胞的能力(圖3k),這表明中性粒細(xì)胞的吸引力是依賴的在C5和UDPG上。重要的是,在MTX-TMP灌注后,作者觀察到患者膽汁引流中UDPG和C5濃度增加(圖3l)??傊琈TX-TMP灌注能夠通過UDPG和C5依賴性途徑吸引嗜中性粒細(xì)胞。
四、MTX–TMPs誘導(dǎo)CCA細(xì)胞凋亡
流式細(xì)胞儀和H&E染色分析了五名患者的引流膽汁中的腫瘤細(xì)胞,作者發(fā)現(xiàn)MTX–TMP灌注以時(shí)間依賴性方式導(dǎo)致CD45?腫瘤細(xì)胞死亡(圖4a)。灌注之前,約有1.8%的CD45-腫瘤細(xì)胞死亡。然而,治療后,死亡的腫瘤細(xì)胞的平均比例分別在4h后增加到9%,在24h和48h之后分別增加到20%和25%(圖4a)。為了驗(yàn)證MTX–TMP殺死CCA細(xì)胞的能力,作者在體外將MTX–TMP與CCA細(xì)胞一起孵育。結(jié)果表明,只有MTX–TMP,而不是單獨(dú)使用藥物或不含藥物的TMP,對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用(圖4b,c)。MTX-TMP介導(dǎo)的細(xì)胞毒性似乎誘導(dǎo)了壞死樣的形態(tài)改變,這是由垂死的細(xì)胞與質(zhì)膜上的特征性大氣泡腫脹所證實(shí)的(圖4c)。大量的胞質(zhì)成分乳酸脫氫酶(LDH)被釋放到上清液中(圖4d),表明程序性壞死細(xì)胞死亡。蛋白質(zhì)印跡分析表明,MTX-TMP處理的人RBE CCA細(xì)胞均未激活MLKL和GSDMD。然而,GSDME被顯著激活(圖4e)。更重要的是,發(fā)現(xiàn)從PDX小鼠模型中分離出的人類原代CCA細(xì)胞表達(dá)高水平的GSDME,MTX-TMP處理導(dǎo)致活性GSDME的產(chǎn)生(圖4g)。與CCA細(xì)胞凋亡一致,作者還發(fā)現(xiàn)5例患者在MTX–TMP灌注后引流中LDH水平升高(圖4h)??傊?,通過GSDME途徑進(jìn)入腫瘤的MTX-TMP觸發(fā)了CCA細(xì)胞的熱凋亡。
五、MTX–TMP灌注觸發(fā)了第二次招募中性粒細(xì)胞的浪潮
作者假設(shè),MTX-TMP介導(dǎo)的焦細(xì)胞凋亡觸發(fā)了中性粒細(xì)胞向膽管遷移的第二波。經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),來自焦光CCA細(xì)胞的上清液可以有效吸引中性粒細(xì)胞(圖5a)。并且用焦磷酸化CCA細(xì)胞上清液處理的巨噬細(xì)胞不僅上調(diào)了IL-6和CCL2,而且還產(chǎn)生了嗜中性粒細(xì)胞引誘劑腫瘤壞死因子(TNF),IL-1β,CCL3,CCL20和CXCL5(圖5b)。巨噬細(xì)胞的上清液能夠有效地吸引嗜中性粒細(xì)胞(圖5c),這表明經(jīng)熱解刺激的巨噬細(xì)胞具有吸引中性粒細(xì)胞的能力。MTX–TMP處理過的人類單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞還產(chǎn)生了多種細(xì)胞因子,例如IL-6,CCL2,CCL3,CCL20和中性粒細(xì)胞引誘劑CXCL1,CXCL5和TNF(圖5d)。此外,兩種吸引巨噬細(xì)胞的化學(xué)因子CCL2和CCL3以及一種天然的吸引T細(xì)胞的趨化因子CCL20在引流中也升高了(圖5e)??傊?,在MTX-TMP灌注后,UDPG對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生了最初的吸引力之后,出現(xiàn)了第二次中性粒細(xì)胞募集的浪潮。
六、MTX–TMP灌注誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞顯示出抗腫瘤表型
為了闡明募集的中性粒細(xì)胞在膽管中的作用,作者從患者中分離了中性粒細(xì)胞,并將其與CCA細(xì)胞孵育。作者發(fā)現(xiàn)這些中性粒細(xì)胞具有殺死腫瘤細(xì)胞的能力(圖6a)。在MTX-TMP灌注后,膽汁中性粒細(xì)胞和膽汁引流年齡發(fā)現(xiàn)活性氧ROS和NO水平升高(圖6b,c)。作者檢查了MTX-TMP對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的作用,發(fā)現(xiàn)處理過的細(xì)胞具有殺死CCA細(xì)胞的能力(圖6d),同時(shí)伴隨著ROS水平的升高(圖6e)。此外,作者發(fā)現(xiàn),MTX-TMP處理過的RBE細(xì)胞的焦上清液還賦予嗜中性粒細(xì)胞殺死CCA細(xì)胞的能力,并增加了ROS水平(圖6f,g)??傊?,MTX-TMP灌注觸發(fā)了多種途徑,這些途徑將膽汁浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞引導(dǎo)至抗腫瘤表型。
結(jié) 論:
這項(xiàng)研究的結(jié)果表明,含有MTX的MTP通過動(dòng)員和激活中性粒細(xì)胞,可以作為一種免疫治療劑,有效治療阻塞性ECCA。 與不攻擊腫瘤細(xì)胞的常規(guī)靶向嗜中性白細(xì)胞的免疫治療劑(例如Coley毒素和卡介苗桿菌Calmette-Guérin免疫療法)不同,MTX-TMP也能夠直接殺死腫瘤細(xì)胞。 更重要的是,這種殺傷作用可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生熱解性死亡,從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥信號(hào),從而壓倒腫瘤的威壓并賦予腫瘤浸潤(rùn)性嗜中性粒細(xì)胞以抗腫瘤表型。