circRNA 001971通過VEGFA促進(jìn)結(jié)直腸癌

        CRC（結(jié)直腸癌）是一種惡性的實(shí)體腫瘤，抑制血管生成(主要通過阻斷VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)家族及其相應(yīng)受體)已被證實(shí)可延長包括CRC在內(nèi)的患者的總體生存期。VEGFA被認(rèn)為是最重要的腫瘤細(xì)胞分泌促血管生成因子之一。進(jìn)一步研究CRC中VEGFA異常上調(diào)的機(jī)制，可能為轉(zhuǎn)移性CRC治療提供新的策略。
        基因表達(dá)受到一些circRNAs的調(diào)控，這些circRNAs充當(dāng)ceRNAs(競爭性內(nèi)源性RNA)，也被認(rèn)為是miRNAs的海綿，影響miRNAs的活性。circRNAs阻止miRNAs調(diào)控其靶基因?；谝陨涎芯勘尘?，中南大學(xué)Chen Chen等人在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research雜志（IF=7.06）發(fā)表文章探究circRNAs通過調(diào)節(jié)VEGFA對結(jié)直腸癌的影響。

技術(shù)路線：

研究結(jié)果：
1.選擇circ-001971
        文章首先根據(jù)以往的文獻(xiàn)報道篩選出11個在CRC腫瘤組織中高表達(dá)的circRNAs，然后利用RT-PCR檢測這11個circRNAs在腫瘤組織和正常組織中表達(dá)差異最大的，發(fā)現(xiàn)有3個circRNAs表達(dá)差異較大，其中circ-001971差異最大。之后，進(jìn)一步在70個組織樣本中檢測，發(fā)現(xiàn)circ-001971在正常和腫瘤組織中表現(xiàn)出差異。COX回歸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circ-001971的表達(dá)與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，低表達(dá)的circ-001971顯示出更高的總體生存率，ROC曲線顯示circ-001971具有潛在的診斷和預(yù)后能力。

2. circ-001971對CRC細(xì)胞增殖、侵襲和HUVEC血管生成的影響
        實(shí)驗(yàn)中選擇了5中CRC細(xì)胞系(HT29, HCT116, LoVo, SW480和 SW620)和正常細(xì)胞系FHC，同在組織中的結(jié)果一樣，circ-001971在腫瘤組織中的表達(dá)比正常組織中多，尤其是HCT116和SW620細(xì)胞。之后，篩選出合適的沉默circ-001971的序列并在沉默circ-001971的細(xì)胞中檢測，發(fā)現(xiàn)沉默的細(xì)胞中DNA的合成能力、細(xì)胞活力和細(xì)胞的侵襲都顯著降低。最后，收集沉默和對照細(xì)胞中的細(xì)胞上清，并用來孵育HUVEC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)circ-001971低表達(dá)降低HUVEC管腔形成能力。

3.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，circ-001971對CRC生長的影響
        研究中采用慢病毒敲低circ-001971，6只小鼠平均分為2組，皮下注射SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染沉默circ-001971或?qū)φ盏穆《据d體，結(jié)果顯示，circ-001971敲低之后顯著降低腫瘤的體積和腫瘤的重量。以上結(jié)果表明在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，circ-001971敲低抑制CRC腫瘤的生長。

4. 選擇并驗(yàn)證與circ-001971和CRC血管生成有關(guān)的miRNA
        研究顯示circRNAs作為miRNA的海綿來減輕miRNA對下游靶基因的抑制。GSE126093和TargetScan預(yù)測miR-29c-3p, miR-497-5p, and miR-943靶向circ-001971。之后，為了找到與circ-001971、CRC血管生成有關(guān)的miRNA，實(shí)驗(yàn)在2種細(xì)胞中過表達(dá)3種miRNAs并發(fā)現(xiàn)3中miRNAs過表達(dá)時circ-001971和VEGFA的表達(dá)降低并且miR-29c-3p能顯著抑制circ-001971的表達(dá)。之后，在細(xì)胞中抑制miR-29c-3p，circ-001971表達(dá)上調(diào)；抑制circ-001971，miR-29c-3p表達(dá)上調(diào)說明兩者的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。而且，miR-29c-3p過表達(dá)顯著降低VEGFA的蛋白水平，miR-29c-3p抑制時升高VEGFA的蛋白水平說明兩者的調(diào)控關(guān)系。

5. MiRNA-29與circ-001971和VEGFA直接結(jié)合
        實(shí)驗(yàn)中采用熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-29c-3p結(jié)合circ-001971 和 VEGFA。并進(jìn)一步用RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示結(jié)果顯示circ-001971、VEGFA、miR-29c- 3p與AGO2相關(guān); 這些數(shù)據(jù)證實(shí)circ-001971和VEGFA結(jié)合miR-29c-3p以AGO2相關(guān)的方式。

6.circRNA/miR-29-3p信號調(diào)節(jié)HUVECs的管腔形成能力
        在兩種細(xì)胞系中， miR-29c-3p抑制時增強(qiáng)VEGFA蛋白水平和管腔形成能力，敲低circ-001971降低VEGFA蛋白水平和管腔形成能力，而抑制miR-29c-3p逆轉(zhuǎn)了circ-001971對VEGFA蛋白表達(dá)和管腔形成能力的影響（理解：挽救實(shí)驗(yàn)）。這些結(jié)果表明.circRNA/miR-29-3p軸調(diào)節(jié)VEGFA蛋白水平和HUVECs的管腔形成能力。

7.組織樣本中miR-29c、 VEGFA的表達(dá)及其與circ- 001971的相關(guān)性
        腫瘤組織中，PCR結(jié)果顯示miR- 29c-3p的表達(dá)降低而VEGFA的表達(dá)增強(qiáng)。WB和IHC結(jié)果顯示腫瘤組織中VEGFA表達(dá)增強(qiáng)。另外，miR-29c-3p與circ- 001971和VEGFA呈負(fù)相關(guān)，而circ-001971與VEGFA呈正相關(guān)。

總 結(jié)：
1.腫瘤組織中，VEGFA表達(dá)上調(diào)，而 miR-29c-3p表達(dá)下調(diào)。
2. miR-29c-3p與circ-001971、VEGFA呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而circ-001971 和VEGFA呈正相關(guān)關(guān)系。
3. circ-001971/miR-29c-3p通過VEGFA調(diào)節(jié)CRC增殖、侵襲和血管生成。
4.為研究circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)對CRC的影響提供了新的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：
Chen C , Huang Z , Mo X , et al. The circular RNA 001971/miR-29c-3p axis modulates colorectal cancer growth, metastasis, and angiogenesis through VEGFA [J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2020, 39(1).