乳腺癌中新的靶點(diǎn) 新的lncRNA出世啦！

    乳腺癌是女性中最常見(jiàn)的一種惡性癌癥，盡管乳腺癌的研究在診斷和聯(lián)合治療方面取得了進(jìn)展，但乳腺癌患者的預(yù)后仍不能令人滿意。lncRNA在癌癥進(jìn)展中扮演著重要的作用，并在癌癥中異常表達(dá)。然而，lncRNA在乳腺癌中功能作用卻有較大一部分不清楚。本文基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，檢測(cè)到lncRNA BCRT1(breast cancer related transcript 1)在乳腺癌組織中的過(guò)表達(dá)，并在乳腺癌組織中進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其對(duì)miR-1303/PTBP3的調(diào)控途徑，為乳腺癌的臨床治療提供了新的靶點(diǎn)。本文于2020年5月8日發(fā)表在《Molecular cancer》。

主要結(jié)果：
1、在乳腺癌中l(wèi)ncRNA BCRT1的表達(dá)上調(diào)且與不良預(yù)后有關(guān)
    使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)GSE112848和TCGA分析與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)的lncRNA表達(dá)譜，(圖1a-b)?？紤]到旨在篩選治療靶點(diǎn)或預(yù)后生物標(biāo)志物，所以作者將重點(diǎn)放上上調(diào)的lncRNA上。其中，lncRNA BCRT1是乳腺癌組織中顯著上調(diào)的lncRNA之一，作者選擇它進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。
    與正常乳腺上皮細(xì)胞（MCF10A）相比，lncRNA BCRT1的表達(dá)在4種乳腺癌細(xì)胞系中都顯著上調(diào)表達(dá)（圖1c）。在18對(duì)乳腺癌組織和正常乳腺癌組織中的PCR檢測(cè)顯示，lncRNA BCRT1在癌組織中顯著高表達(dá)，并且lncRNA BCRT1在乳腺癌伴有遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移的組織中也是高表達(dá)（圖1d）；此外，lncRNA BCRT1高表達(dá)與無(wú)疾病生存期和總體存活率的明顯下降有關(guān)（圖1e）。亞細(xì)胞定位顯示lncRNA BCRT1主要分布在細(xì)胞質(zhì)（圖1f和g）。總之，這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了lncRNA BCRT1在乳腺癌中上調(diào)和lncRNA BCRT1的高表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)。

圖1 LncRNA BCRT1的上調(diào)與乳腺癌的進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)

2、LncRNA BCRT1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)
    為了驗(yàn)證lncRNA BCRT1在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，利用siRNA敲除lncRNA BCRT1，其干擾效率如圖2a。lncRNA BCRT1敲除后，乳腺癌細(xì)胞的增殖、集落形成和DNA合成效率都顯著下降（圖2b-d），而乳腺癌細(xì)胞的總體死亡率則顯著增加（圖2e）。相反地，構(gòu)建使lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)的pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，其表達(dá)和增殖都顯著升高（圖2f-g）。此外，使用皮下異種移植模型驗(yàn)證lncRNA BCRT1在大鼠體內(nèi)的生物學(xué)功能。與體外一致，與對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)lncRNA BCRT1顯著增加了腫瘤的重量和體積（圖2h-i）。免疫組織化學(xué)（IHC）實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)lncRNA BCRT1后，大鼠體內(nèi)Ki67的表達(dá)量增加，暗示著細(xì)胞增殖增加（圖2j）。上述結(jié)果表明lncRNA BCRT1在體內(nèi)外均可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。

圖2 LncRNA BCRT1基因下調(diào)抑制乳腺癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)增殖

3、LncRNA BCRT1促進(jìn)細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移
    之后作者探究了lncRNA BCRT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果顯示，敲除lncRNA BCRT1后顯著損害了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，相反，過(guò)表達(dá)lncRNA BCRT1則乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)力提高（圖3a-b）。此外，使用乳腺癌的條件培養(yǎng)基去刺激HUVECs的血管生成以評(píng)估體外血管生成活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，lncRNA BCRT1敲除組的血管平均長(zhǎng)度顯著下降，而過(guò)表達(dá)則相反（圖3c）。
    鑒于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是癌癥轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制，所以對(duì)LncRNA BCRT1是否影響EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行探究。WB顯示，敲除LncRNA BCRT1可以增加上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，且降低間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Fibronectin，N-cadherin，和Vimentin的表達(dá)（圖3d），暗示著lncRNA BCRT1可以調(diào)節(jié)EMT過(guò)程從而調(diào)控乳腺癌的進(jìn)展。
    為了在體內(nèi)驗(yàn)證上述結(jié)果，通過(guò)將乳腺癌細(xì)胞尾靜脈注射構(gòu)建裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型。對(duì)照組中的2只老鼠和lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)組全部的5只老鼠在4周后出現(xiàn)了肺部轉(zhuǎn)移灶（圖3e）。然后取這些大鼠的肺組織，進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)LncRNA BCRT1顯著增加了大鼠肺部轉(zhuǎn)移灶的的體積和數(shù)量（圖3f）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，lncRNA BCRT1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)移。

圖3 LncRNA BCRT1的下調(diào)抑制了乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移

4、LncRNA BCRT1在乳腺癌細(xì)胞中充當(dāng)miR-1303的海綿
    鑒于lncRNA BCRT1定位于細(xì)胞質(zhì)，作者推測(cè)lncRNA BCRT1可能通過(guò)調(diào)控miRNA來(lái)發(fā)揮功能，經(jīng)過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)miR-1303可能是lncRNA BCRT1的潛在靶標(biāo)（圖4a）。熒光素酶結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-1303顯著降低了lncRNA BCRT1野生型的熒光素酶活性，但是不影響突變體的活性（圖4b）。AGO2的免疫沉淀結(jié)果顯示，AGO2抗體可以拉下內(nèi)源性lncRNA BCRT1和miR-1303（圖4c）。此外，敲除lncRNA BCRT1后miR-1303的表達(dá)顯著升高（圖4d）。上述結(jié)果表明miR-1303是乳腺癌中l(wèi)ncRNA BCRT1的一個(gè)抑制靶點(diǎn)。
    進(jìn)一步地，探究miR-1303在乳腺癌細(xì)胞中的功能。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-1303導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的增殖效率下降，而死亡率增加，遷移和侵襲也下降（圖4e-h）。救援實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了lncRNA BCRT1與miR-1303的功能關(guān)系。

圖4 LncRNA BCRT1在乳腺癌中充當(dāng)miR-1303的海綿。

5、LncRNA BCRT1通過(guò)抑制miR-1303上調(diào)PTBP3的表達(dá)
    作者使用4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到PTBP3可能是miR-1303的潛在靶點(diǎn)，此外，PTBP3在乳腺癌組織中上調(diào)表達(dá)，且高表達(dá)水平的PTBP3與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，重要的是，乳腺癌細(xì)胞中PTBP3的表達(dá)水平和lncRNA BCRT1的表達(dá)成正相關(guān)（圖5a-c）。熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-1303導(dǎo)致野生型PTBP3的活性下降而對(duì)突變型的無(wú)影響，表明PTBP3是miR-1303的直接靶標(biāo)（圖5d）。此外，PTBP3的mRNA水平和蛋白水平均由于miRNA的過(guò)表達(dá)或lncRNA BCRT1敲除而下降（圖5f）。在拯救實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)miR-1303可以部分抵消因過(guò)表達(dá)lncRNA BCRT1引起的PTBP3表達(dá)升高的情況（圖5g）。此外，敲除PTBP3可顯著抑制細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡，減弱細(xì)胞的遷移和侵襲(圖5h-k)。上述結(jié)果表明lncRNA BCRT1通過(guò)調(diào)控miR-1303調(diào)控PTBP3的表達(dá)最終影響乳腺癌的進(jìn)展。

圖5 LncRNA BCRT1通過(guò)保護(hù)PTBP3不受miR -1303誘導(dǎo)的降解而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和進(jìn)展

6、外泌體lncRNA BCRT1促進(jìn)M2表型極化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤進(jìn)
    此前的研究表明腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞（TAMs），其M2表型，是腫瘤微環(huán)境（TME）中最豐富的細(xì)胞，并且通過(guò)調(diào)控血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸參與腫瘤進(jìn)展。為了探究lncRNA BCRT1是否參與M2極化，作者評(píng)估了未極化的巨噬細(xì)胞、LPS/INF-γ-induced M1巨噬細(xì)胞、IL-4/IL-13-induced M2巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BCRT1，M1和M2標(biāo)記物的表達(dá)。結(jié)果顯示M1巨噬細(xì)胞中M1相關(guān)基因(CD80、MCP-1、iNOS、IL-6)表達(dá)水平顯著上調(diào)，M2巨噬細(xì)胞中M2相關(guān)基因(CD206、MRC-2)表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖6a)，這表明單核細(xì)胞極化成功。此外，與M1巨噬細(xì)胞相比，lncRNA BCRT1在M2巨噬細(xì)胞中表達(dá)顯著升高(圖6b)，提示lncRNA BCRT1在巨噬細(xì)胞極化中的潛在作用。使用PMA處理24 h后，用si- NC或si- bcrt1轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，然后加入IL-4和IL-13 24 h，誘導(dǎo)M2表型。結(jié)果顯示，si-BCRT1組M1標(biāo)記顯著增加，M2標(biāo)記顯著減少(圖6c)。此外，與對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞相比，lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞的上清導(dǎo)致M2標(biāo)記物的表達(dá)升高(圖6e)。
    為了研究lncRNA BCRT1是否能被外泌體吸收，作者從乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取外泌體，并使用WB檢測(cè)外泌體蛋白如CD63、HSP70和HSP90的表達(dá)(圖6f)。在MDA-MB-231細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致分泌的外泌體中l(wèi)ncRNA BCRT1的水平升高，而lncRNA BCRT1的敲除產(chǎn)生相反的結(jié)果（圖6g），表明外泌體中存在lncRNA BCRT1。使用PKH26標(biāo)記MDA-MB-231細(xì)胞衍生的外泌體，并將其與巨噬細(xì)胞一起溫育以檢查外泌體摻入，并確認(rèn)標(biāo)記的外泌體RNA可以被巨噬細(xì)胞內(nèi)化（圖6h）。
    為了進(jìn)一步研究lncRNA BCRT1誘導(dǎo)的M2表型巨噬細(xì)胞是否具有促進(jìn)腫瘤的特征功能，使用外泌體或從lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)或?qū)φ占?xì)胞中分離的上清液處理了巨噬細(xì)胞。然后，收集受過(guò)教育的巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，并用于治療乳腺癌細(xì)胞或HUVEC。結(jié)果表明，使用外泌體或從lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)分離的上清液處理的巨噬細(xì)胞顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成（圖6j-k），此外，也導(dǎo)致雛雞胚胎的新血管密度增加（圖6l）。
    綜上所述，這些結(jié)果表明lncRNA BCRT1可以通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)M2表型極化并增強(qiáng)其腫瘤促進(jìn)功能。

圖6 lncRNA BCRT1可被乳腺癌細(xì)胞分泌并促進(jìn)M2極化

7、缺氧條件下lncRNA BCRT1受到HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    缺氧是各種癌癥的主要腫瘤內(nèi)特征之一，一些研究表明，癌癥的低氧微環(huán)境可能是導(dǎo)致某些lncRNAs異常表達(dá)的原因，因而作者對(duì)lncRNA BCRT1是否對(duì)缺氧誘導(dǎo)敏感進(jìn)行了探究。結(jié)果顯示lncRNA BCRT1的表達(dá)隨著HIF-1α的表達(dá)而升高（圖7a-b）。無(wú)論常氧還缺氧情況下，HIF-1α的敲除都導(dǎo)致HIF-1α和lncRNA BCRT1的表達(dá)急劇下降，并且HIF-1α的敲除大幅消減了因缺氧誘導(dǎo)引起的lncRNA BCRT1的表達(dá)增加（圖7c-e）。圖7f-g為lncRNA BCRT1上預(yù)測(cè)到的兩個(gè)HIF-1α響應(yīng)元件（HREs）。進(jìn)一步地，缺氧處理顯著提高了轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)lncRNA BCRT1啟動(dòng)子載體的細(xì)胞的熒光素酶活性，而HRE1的缺失則降低了熒光素酶活性，這表明HRE1對(duì)lncRNA BCRT1的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要(圖7h)。此外，HIF-1α敲除顯著反轉(zhuǎn)了因缺氧處理引起的熒光素酶活性，這表明缺氧促進(jìn)lncRNA BCRT1轉(zhuǎn)錄是通過(guò)將HIF-1α的HRE1與其啟動(dòng)子區(qū)域綁定。染色質(zhì)免疫沉淀進(jìn)一步證明了這個(gè)結(jié)果（圖7i）。另一方面，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)PTBP3的表達(dá)與HIF-1α成正相關(guān)（圖7j），并且缺氧處理導(dǎo)致PTBP3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高(圖7 k),而HIF-1α敲除減弱了這種影響(圖7l)。以上結(jié)果表明缺氧轉(zhuǎn)錄調(diào)控lncRNA BCRT1表達(dá)是通過(guò)直接將HIF-1α HRE1綁定在啟動(dòng)子。

圖7在缺氧期間LncRNA BCRT1受到HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

8、LncRNA BCRT1介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞惡性特性
    缺氧是TAM的特征之一，與腫瘤的增殖，轉(zhuǎn)移和藥物抗性相關(guān)，因此，進(jìn)一步研究LncRNA BCRT1是否參與了缺氧誘導(dǎo)的生物學(xué)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)導(dǎo)致LncRNA BCRT1和PTBP3的表達(dá)及細(xì)胞增殖增加，而lncRNA BCRT1和HIF-1α敲除能消除這種作用，此外，lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)可以部分反轉(zhuǎn)HIF-1α敲除引起的抑制作用（圖8a-c）。與缺氧處理后，MDA-MB-231細(xì)胞表現(xiàn)出更多的形態(tài)和遷移能力升高，但HIF-1α或lncRNA BCRT1敲除戲劇性的逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果（圖8d-f）。這些結(jié)果表明lncRNA BCRT1可能參與了缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。

圖8 LncRNA BCRT1對(duì)于HIF-1α介導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)腫瘤惡性屬性至關(guān)重要

總  結(jié)：
    總之，本文發(fā)現(xiàn)低氧反應(yīng)型lncRNA BCRT1是乳腺癌的腫瘤促進(jìn)劑，而lncRNA BCRT1的高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。LncRNA BCRT1充當(dāng)miR-1303的海綿，以減輕其對(duì)PTBP3的抑制作用，并通過(guò)外泌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移促進(jìn)M2極化。 本文幫助大家更好地了解lncRNA在乳腺癌進(jìn)展中的作用，以及提供了針對(duì)這種惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)。
參考文獻(xiàn)：
Liang Yiran., Song Xiaojin., Li Yaming., Chen Bing., Zhao Wenjing., Wang Lijuan., Zhang Hanwen., Liu Ying., Han Dianwen., Zhang Ning., Ma Tingting., Wang Yajie., Ye Fangzhou., Luo Dan., Li Xiaoyan., Yang Qifeng.(2020). LncRNA BCRT1 promotes breast cancer progression by targeting miR-1303/PTBP3 axis. Mol. Cancer, 19(1), 85. Doi: 10.1186/s12943-020-01206-5