乳腺癌中新的靶點 新的lncRNA出世啦！

    乳腺癌是女性中最常見的一種惡性癌癥，盡管乳腺癌的研究在診斷和聯(lián)合治療方面取得了進展，但乳腺癌患者的預后仍不能令人滿意。lncRNA在癌癥進展中扮演著重要的作用，并在癌癥中異常表達。然而，lncRNA在乳腺癌中功能作用卻有較大一部分不清楚。本文基于公共數(shù)據(jù)庫，結(jié)合生物信息學分析，檢測到lncRNA BCRT1(breast cancer related transcript 1)在乳腺癌組織中的過表達，并在乳腺癌組織中進一步驗證發(fā)現(xiàn)其對miR-1303/PTBP3的調(diào)控途徑，為乳腺癌的臨床治療提供了新的靶點。本文于2020年5月8日發(fā)表在《Molecular cancer》。

主要結(jié)果：
1、在乳腺癌中l(wèi)ncRNA BCRT1的表達上調(diào)且與不良預后有關(guān)
    使用公共數(shù)據(jù)庫GSE112848和TCGA分析與乳腺癌進展相關(guān)的lncRNA表達譜，(圖1a-b)?？紤]到旨在篩選治療靶點或預后生物標志物，所以作者將重點放上上調(diào)的lncRNA上。其中，lncRNA BCRT1是乳腺癌組織中顯著上調(diào)的lncRNA之一，作者選擇它進行進一步的評估。
    與正常乳腺上皮細胞（MCF10A）相比，lncRNA BCRT1的表達在4種乳腺癌細胞系中都顯著上調(diào)表達（圖1c）。在18對乳腺癌組織和正常乳腺癌組織中的PCR檢測顯示，lncRNA BCRT1在癌組織中顯著高表達，并且lncRNA BCRT1在乳腺癌伴有遠程轉(zhuǎn)移的組織中也是高表達（圖1d）；此外，lncRNA BCRT1高表達與無疾病生存期和總體存活率的明顯下降有關(guān)（圖1e）。亞細胞定位顯示lncRNA BCRT1主要分布在細胞質(zhì)（圖1f和g）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了lncRNA BCRT1在乳腺癌中上調(diào)和lncRNA BCRT1的高表達與乳腺癌預后不良有關(guān)。

圖1 LncRNA BCRT1的上調(diào)與乳腺癌的進展和預后不良有關(guān)

2、LncRNA BCRT1促進乳腺癌細胞增殖和腫瘤生長
    為了驗證lncRNA BCRT1在乳腺癌細胞中的生物學功能，利用siRNA敲除lncRNA BCRT1，其干擾效率如圖2a。lncRNA BCRT1敲除后，乳腺癌細胞的增殖、集落形成和DNA合成效率都顯著下降（圖2b-d），而乳腺癌細胞的總體死亡率則顯著增加（圖2e）。相反地，構(gòu)建使lncRNA BCRT1過表達的pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞后，其表達和增殖都顯著升高（圖2f-g）。此外，使用皮下異種移植模型驗證lncRNA BCRT1在大鼠體內(nèi)的生物學功能。與體外一致，與對照相比，過表達lncRNA BCRT1顯著增加了腫瘤的重量和體積（圖2h-i）。免疫組織化學（IHC）實驗證實過表達lncRNA BCRT1后，大鼠體內(nèi)Ki67的表達量增加，暗示著細胞增殖增加（圖2j）。上述結(jié)果表明lncRNA BCRT1在體內(nèi)外均可促進乳腺癌細胞增殖。

圖2 LncRNA BCRT1基因下調(diào)抑制乳腺癌細胞的體外和體內(nèi)增殖

3、LncRNA BCRT1促進細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移
    之后作者探究了lncRNA BCRT1對乳腺癌細胞運動能力的影響。結(jié)果顯示，敲除lncRNA BCRT1后顯著損害了乳腺癌細胞的遷移和侵襲，相反，過表達lncRNA BCRT1則乳腺癌細胞的運動力提高（圖3a-b）。此外，使用乳腺癌的條件培養(yǎng)基去刺激HUVECs的血管生成以評估體外血管生成活性。結(jié)果顯示，與對照相比，lncRNA BCRT1敲除組的血管平均長度顯著下降，而過表達則相反（圖3c）。
    鑒于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是癌癥轉(zhuǎn)移的主要機制，所以對LncRNA BCRT1是否影響EMT相關(guān)標志物的表達進行探究。WB顯示，敲除LncRNA BCRT1可以增加上皮標志物E-cadherin的表達，且降低間質(zhì)細胞標記物Fibronectin，N-cadherin，和Vimentin的表達（圖3d），暗示著lncRNA BCRT1可以調(diào)節(jié)EMT過程從而調(diào)控乳腺癌的進展。
    為了在體內(nèi)驗證上述結(jié)果，通過將乳腺癌細胞尾靜脈注射構(gòu)建裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型。對照組中的2只老鼠和lncRNA BCRT1過表達組全部的5只老鼠在4周后出現(xiàn)了肺部轉(zhuǎn)移灶（圖3e）。然后取這些大鼠的肺組織，進行HE染色，結(jié)果顯示，過表達LncRNA BCRT1顯著增加了大鼠肺部轉(zhuǎn)移灶的的體積和數(shù)量（圖3f）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，lncRNA BCRT1促進乳腺癌細胞的腫瘤轉(zhuǎn)移。

圖3 LncRNA BCRT1的下調(diào)抑制了乳腺癌細胞的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移

4、LncRNA BCRT1在乳腺癌細胞中充當miR-1303的海綿
    鑒于lncRNA BCRT1定位于細胞質(zhì)，作者推測lncRNA BCRT1可能通過調(diào)控miRNA來發(fā)揮功能，經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)miR-1303可能是lncRNA BCRT1的潛在靶標（圖4a）。熒光素酶結(jié)果顯示，過表達miR-1303顯著降低了lncRNA BCRT1野生型的熒光素酶活性，但是不影響突變體的活性（圖4b）。AGO2的免疫沉淀結(jié)果顯示，AGO2抗體可以拉下內(nèi)源性lncRNA BCRT1和miR-1303（圖4c）。此外，敲除lncRNA BCRT1后miR-1303的表達顯著升高（圖4d）。上述結(jié)果表明miR-1303是乳腺癌中l(wèi)ncRNA BCRT1的一個抑制靶點。
    進一步地，探究miR-1303在乳腺癌細胞中的功能。結(jié)果顯示，過表達miR-1303導致乳腺癌細胞的增殖效率下降，而死亡率增加，遷移和侵襲也下降（圖4e-h）。救援實驗進一步驗證了lncRNA BCRT1與miR-1303的功能關(guān)系。

圖4 LncRNA BCRT1在乳腺癌中充當miR-1303的海綿。

5、LncRNA BCRT1通過抑制miR-1303上調(diào)PTBP3的表達
    作者使用4個數(shù)據(jù)庫篩選到PTBP3可能是miR-1303的潛在靶點，此外，PTBP3在乳腺癌組織中上調(diào)表達，且高表達水平的PTBP3與乳腺癌的不良預后有關(guān)，重要的是，乳腺癌細胞中PTBP3的表達水平和lncRNA BCRT1的表達成正相關(guān)（圖5a-c）。熒光素酶實驗證實過表達miR-1303導致野生型PTBP3的活性下降而對突變型的無影響，表明PTBP3是miR-1303的直接靶標（圖5d）。此外，PTBP3的mRNA水平和蛋白水平均由于miRNA的過表達或lncRNA BCRT1敲除而下降（圖5f）。在拯救實驗中，過表達miR-1303可以部分抵消因過表達lncRNA BCRT1引起的PTBP3表達升高的情況（圖5g）。此外，敲除PTBP3可顯著抑制細胞增殖，增加細胞凋亡，減弱細胞的遷移和侵襲(圖5h-k)。上述結(jié)果表明lncRNA BCRT1通過調(diào)控miR-1303調(diào)控PTBP3的表達最終影響乳腺癌的進展。

圖5 LncRNA BCRT1通過保護PTBP3不受miR -1303誘導的降解而促進乳腺癌細胞的增殖和進展

6、外泌體lncRNA BCRT1促進M2表型極化，促進巨噬細胞誘導的腫瘤進
    此前的研究表明腫瘤相關(guān)的巨噬細胞（TAMs），其M2表型，是腫瘤微環(huán)境（TME）中最豐富的細胞，并且通過調(diào)控血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸參與腫瘤進展。為了探究lncRNA BCRT1是否參與M2極化，作者評估了未極化的巨噬細胞、LPS/INF-γ-induced M1巨噬細胞、IL-4/IL-13-induced M2巨噬細胞中l(wèi)ncRNA BCRT1，M1和M2標記物的表達。結(jié)果顯示M1巨噬細胞中M1相關(guān)基因(CD80、MCP-1、iNOS、IL-6)表達水平顯著上調(diào)，M2巨噬細胞中M2相關(guān)基因(CD206、MRC-2)表達水平顯著上調(diào)(圖6a)，這表明單核細胞極化成功。此外，與M1巨噬細胞相比，lncRNA BCRT1在M2巨噬細胞中表達顯著升高(圖6b)，提示lncRNA BCRT1在巨噬細胞極化中的潛在作用。使用PMA處理24 h后，用si- NC或si- bcrt1轉(zhuǎn)染THP-1細胞，然后加入IL-4和IL-13 24 h，誘導M2表型。結(jié)果顯示，si-BCRT1組M1標記顯著增加，M2標記顯著減少(圖6c)。此外，與對照組MDA-MB-231細胞相比，lncRNA BCRT1過表達MDA-MB-231細胞的上清導致M2標記物的表達升高(圖6e)。
    為了研究lncRNA BCRT1是否能被外泌體吸收，作者從乳腺癌細胞培養(yǎng)上清中提取外泌體，并使用WB檢測外泌體蛋白如CD63、HSP70和HSP90的表達(圖6f)。在MDA-MB-231細胞中l(wèi)ncRNA BCRT1過表達導致分泌的外泌體中l(wèi)ncRNA BCRT1的水平升高，而lncRNA BCRT1的敲除產(chǎn)生相反的結(jié)果（圖6g），表明外泌體中存在lncRNA BCRT1。使用PKH26標記MDA-MB-231細胞衍生的外泌體，并將其與巨噬細胞一起溫育以檢查外泌體摻入，并確認標記的外泌體RNA可以被巨噬細胞內(nèi)化（圖6h）。
    為了進一步研究lncRNA BCRT1誘導的M2表型巨噬細胞是否具有促進腫瘤的特征功能，使用外泌體或從lncRNA BCRT1過表達或?qū)φ占毎蟹蛛x的上清液處理了巨噬細胞。然后，收集受過教育的巨噬細胞的條件培養(yǎng)基，并用于治療乳腺癌細胞或HUVEC。結(jié)果表明，使用外泌體或從lncRNA BCRT1過表達分離的上清液處理的巨噬細胞顯著促進細胞遷移和血管生成（圖6j-k），此外，也導致雛雞胚胎的新血管密度增加（圖6l）。
    綜上所述，這些結(jié)果表明lncRNA BCRT1可以通過外泌體轉(zhuǎn)移，從而促進M2表型極化并增強其腫瘤促進功能。

圖6 lncRNA BCRT1可被乳腺癌細胞分泌并促進M2極化

7、缺氧條件下lncRNA BCRT1受到HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    缺氧是各種癌癥的主要腫瘤內(nèi)特征之一，一些研究表明，癌癥的低氧微環(huán)境可能是導致某些lncRNAs異常表達的原因，因而作者對lncRNA BCRT1是否對缺氧誘導敏感進行了探究。結(jié)果顯示lncRNA BCRT1的表達隨著HIF-1α的表達而升高（圖7a-b）。無論常氧還缺氧情況下，HIF-1α的敲除都導致HIF-1α和lncRNA BCRT1的表達急劇下降，并且HIF-1α的敲除大幅消減了因缺氧誘導引起的lncRNA BCRT1的表達增加（圖7c-e）。圖7f-g為lncRNA BCRT1上預測到的兩個HIF-1α響應元件（HREs）。進一步地，缺氧處理顯著提高了轉(zhuǎn)染全長lncRNA BCRT1啟動子載體的細胞的熒光素酶活性，而HRE1的缺失則降低了熒光素酶活性，這表明HRE1對lncRNA BCRT1的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要(圖7h)。此外，HIF-1α敲除顯著反轉(zhuǎn)了因缺氧處理引起的熒光素酶活性，這表明缺氧促進lncRNA BCRT1轉(zhuǎn)錄是通過將HIF-1α的HRE1與其啟動子區(qū)域綁定。染色質(zhì)免疫沉淀進一步證明了這個結(jié)果（圖7i）。另一方面，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)PTBP3的表達與HIF-1α成正相關(guān)（圖7j），并且缺氧處理導致PTBP3 mRNA和蛋白的表達水平升高(圖7 k),而HIF-1α敲除減弱了這種影響(圖7l)。以上結(jié)果表明缺氧轉(zhuǎn)錄調(diào)控lncRNA BCRT1表達是通過直接將HIF-1α HRE1綁定在啟動子。

圖7在缺氧期間LncRNA BCRT1受到HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

8、LncRNA BCRT1介導低氧誘導的乳腺癌細胞惡性特性
    缺氧是TAM的特征之一，與腫瘤的增殖，轉(zhuǎn)移和藥物抗性相關(guān)，因此，進一步研究LncRNA BCRT1是否參與了缺氧誘導的生物學功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧誘導導致LncRNA BCRT1和PTBP3的表達及細胞增殖增加，而lncRNA BCRT1和HIF-1α敲除能消除這種作用，此外，lncRNA BCRT1過表達可以部分反轉(zhuǎn)HIF-1α敲除引起的抑制作用（圖8a-c）。與缺氧處理后，MDA-MB-231細胞表現(xiàn)出更多的形態(tài)和遷移能力升高，但HIF-1α或lncRNA BCRT1敲除戲劇性的逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果（圖8d-f）。這些結(jié)果表明lncRNA BCRT1可能參與了缺氧誘導的乳腺癌細胞的生物學功能。

圖8 LncRNA BCRT1對于HIF-1α介導的低氧誘導腫瘤惡性屬性至關(guān)重要

總  結(jié)：
    總之，本文發(fā)現(xiàn)低氧反應型lncRNA BCRT1是乳腺癌的腫瘤促進劑，而lncRNA BCRT1的高表達與腫瘤轉(zhuǎn)移和不良預后有關(guān)。LncRNA BCRT1充當miR-1303的海綿，以減輕其對PTBP3的抑制作用，并通過外泌體介導的轉(zhuǎn)移促進M2極化。 本文幫助大家更好地了解lncRNA在乳腺癌進展中的作用，以及提供了針對這種惡性腫瘤的潛在治療靶點和預后指標。
參考文獻：
Liang Yiran., Song Xiaojin., Li Yaming., Chen Bing., Zhao Wenjing., Wang Lijuan., Zhang Hanwen., Liu Ying., Han Dianwen., Zhang Ning., Ma Tingting., Wang Yajie., Ye Fangzhou., Luo Dan., Li Xiaoyan., Yang Qifeng.(2020). LncRNA BCRT1 promotes breast cancer progression by targeting miR-1303/PTBP3 axis. Mol. Cancer, 19(1), 85. Doi: 10.1186/s12943-020-01206-5