證據(jù)證據(jù)證據(jù)！外泌體circUHRF1抑制自然殺傷細(xì)胞功能

    自然殺傷細(xì)胞(NK)在天然抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。近年來，NK細(xì)胞功能障礙在包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中得到證實。然而，NK細(xì)胞功能障礙在人HCC中的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。本文部分回答了該問題：HCC來源的外泌體通過誘導(dǎo)NK細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)抑制IFN-γ和TNFα的產(chǎn)生。本文于2020年6月27日發(fā)表在《Molecular cancer》期刊上。
技術(shù)路線：

主要結(jié)果：
1、HCC組織中UHRF1相關(guān)circRNA的分析
    UHRF1通常在HCC進(jìn)展中上調(diào)表達(dá)，此外，circRNA是pre-mRNAs的反向剪切產(chǎn)物且通常被認(rèn)為是癌細(xì)胞中pre-mRNAs剪切的副產(chǎn)物。一般來說，circRNAs的水平通常與各自的mRNA水平一致，因此，作者檢測了UHRF1來源的14種circRNA的表達(dá)水平（Fig.1A），其中hsa_circ_0048677 (circUHRF1)的表達(dá)最豐富且在HCC中顯著上調(diào)（Fig.1B）。進(jìn)一步地，作者發(fā)現(xiàn)circUHRF1的表達(dá)在癌中顯著高于癌旁組織，且circUHRF1高表達(dá)的病人具有更大的腫瘤體積，血液中NK細(xì)胞含量更低，更多的微血管入侵以及更差的預(yù)后（Fig.1C-I）。

圖1 circUHRF1在HCC組織中上調(diào)表達(dá)

2、HCC細(xì)胞以外泌體方式分泌circUHRF1
    前人的研究表明可以通過外泌體在細(xì)胞間運(yùn)輸，因此，作者猜測circUHRF1可能被HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至其它細(xì)胞，為了驗證這個猜想，作者從HCC細(xì)胞系上清中分離鑒定到外泌體（Fig.A-B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circUHRF1在六種HCC細(xì)胞系和對應(yīng)的外泌體中的表達(dá)趨勢一致，且HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞系及其外泌體中的表達(dá)顯著高于其它細(xì)胞系（Fig.C-D）。此外，檢測發(fā)現(xiàn)circUHRF1存在與血漿中，并且HCC病人中血漿外泌體circUHRF1顯著高于健康志愿者，接受腫瘤切除術(shù)的病人外泌體circUHRF1含量降低，腫瘤逃逸的病人外泌體circUHRF1含量升高，這些結(jié)果說明血漿外泌體circUHRF1主要有HCC細(xì)胞產(chǎn)生（Fig.E）。有趣的是，有免疫逃避機(jī)制的患者血漿外泌體circUHRF1水平顯著升高，外周血NK細(xì)胞比例降低（Fig.F）。這表明血漿外泌體circUHRF1可以作為NK細(xì)胞相關(guān)免疫逃逸的關(guān)鍵分子決定因素。

圖2 circUHRF1的表達(dá)及特性

3、HCC細(xì)胞抑制NK細(xì)胞功能通過外泌體circUHRF1
    為了確定HCC細(xì)胞的外泌體circUHRF1是否誘導(dǎo)改變異種NK細(xì)胞，作者將6個健康供體的NK細(xì)胞和HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞系以對等比例共培養(yǎng)24小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨培養(yǎng)NK細(xì)胞相比，共培養(yǎng)后細(xì)胞IFN-γ和TNFα的分泌顯著受損（Fig.3A-C）。此外，NK細(xì)胞和HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞系共培養(yǎng)后顯著增加了circUHRF1表達(dá)，但是這種增加被外泌體抑制劑GW4869抑制（Fig.3D-E）。不僅如此，加入外泌體抑制劑后NK細(xì)胞中IFN-γ和TNFα的分泌在是否與HCC細(xì)胞共培養(yǎng)的組間沒有表現(xiàn)出差異（Fig.3F-G）。此外，circUHRF1沉默后HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞外泌體中circUHRF1的表達(dá)顯著下降，而IFN-γ和TNFα的分泌顯著升高（Fig.3H-J）。上述結(jié)果表明HCC來源的外泌體circUHRF1損傷NK細(xì)胞的功能。

圖3 外泌體表達(dá)circUHRF1抑制NK細(xì)胞的功能

4、在NK細(xì)胞中，circUHRF1和miR-449c-5p相互降解
    作者進(jìn)一步探究circUHRF1在NK-92細(xì)胞中可以結(jié)合miRNA，通過StarBase v3.0分析，預(yù)測到14個潛在的靶miRNAs。使用circUHRF1特異性和NC探針進(jìn)行體內(nèi)circUHRF1沉淀，然后檢測circUHRF1復(fù)合物中14個靶miRNAs的表達(dá)。實驗發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物中顯著富集miR-449c-5p，而其它則少有富集（Fig.4A）。然后，在NK-92細(xì)胞中使用anti-AGO2抗體進(jìn)行RIP實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circUHRF1和miR-449c-5p在anti-AGO2抗體中顯著富集，這些結(jié)果表明circUHRF1可能是miR-449c-5p和AGO2的結(jié)合平臺（Fig.4B）。為了進(jìn)一步驗證這個結(jié)果，進(jìn)行了生物素標(biāo)記的miR-449c-5p的pulldown實驗，結(jié)果表明與NC相比，circUHRF1顯著富集（Fig.4C）。熒光素酶實驗結(jié)果顯示，與NC相比，miR-449c-5p顯著降低了野生型circUHRF1的熒光素酶活性，但對突變型的沒有影響（Fig.4D-E）。有趣的是，circUHRF1的表達(dá)水平可以被過表達(dá)miR-449c-5p顯著抑制，反過來，miR-449c-5p的表達(dá)也可以被過表達(dá)circUHRF1顯著抑制（Fig.4F-G）。這些結(jié)果表明circUHRF1和miR-449c-5p相互靶向結(jié)合。

圖4 circUHRF1抑制miR-449c-5p在NK細(xì)胞中的生物學(xué)功能

5、circUHRF1上調(diào)TIM-3的表達(dá)通過抑制miR-449c-5p活性
    通過上述實驗結(jié)果，作者猜測circUHRF1可能通過miR-449c-5p海綿上調(diào)其靶點的水平進(jìn)而增強(qiáng)HCC病人的免疫逃逸。為了驗證這個猜想，作者首先分析了NK細(xì)胞中miR-449c-5p靶點的表達(dá)水平，包括TIM，然后使用熒光素酶實驗進(jìn)一步驗證miR-449c-5p與TIM的結(jié)合（Fig.5A-B）。強(qiáng)制表達(dá)miR-449c-5p后，TIM的表達(dá)顯著下降（Fig.5C-D）。此外，circUHRF1的表達(dá)與miR-449c-5p的表達(dá)負(fù)相關(guān)，與TIM的表達(dá)呈正相關(guān)，miR-449c-5p的表達(dá)也與TIM的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（Fig.5E-G）。以上研究結(jié)果表明circUHRF1/miR-449c5p/TIM-3軸聯(lián)合作用影響NK細(xì)胞的功能。

圖5 在NK細(xì)胞中，circUHFR1調(diào)控miR-449c-5p/ TIM-3通路

6、circUHFR1以NK細(xì)胞依賴的方式誘導(dǎo)HCC的進(jìn)展
    慢病毒載體pLO5-ciRcircUHRF1顯著提高了細(xì)胞和外泌體中circUHFR1的表達(dá)，以及NOD/SCID小鼠模型體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（Fig.6A-C）。此外，過表達(dá)circUHFR1具有肺轉(zhuǎn)移的小鼠體內(nèi)血漿外泌體circUHFR1的含量顯著升高，而NKG2D陽性細(xì)胞數(shù)量顯著下降（Fig.6D-E）。這些結(jié)果表明circUHFR1以依賴外泌體和NK細(xì)胞的方式促進(jìn)HCC進(jìn)展。

圖6 circUHRF1以NK細(xì)胞依賴的方式誘導(dǎo)免疫逃逸

7、circUHRF1增強(qiáng)HCC對抗PD1治療的耐藥性
    鑒于強(qiáng)制表達(dá)circUHRF1抑制NK細(xì)胞的功能，所以接下來作者評估過表達(dá)circUHRF1是否會進(jìn)一步阻礙anti-PD1的抗腫瘤作用。作者回顧性分析了30例在免疫治療前2-36個月行肝切除術(shù)并接受抗PD1免疫治療的復(fù)發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(包括肺轉(zhuǎn)移)的HCC患者的資料。6個治療周期后，評估CT療效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個病人表現(xiàn)部分響應(yīng)（PR），7個病人表現(xiàn)穩(wěn)定疾?。⊿D），20個病人表現(xiàn)進(jìn)行性疾病。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circUHRF1的表達(dá)水平在PD組顯著高于SD組和PR組，而NKG2D陽性細(xì)胞數(shù)量在PD組顯著低于SD組和PR組，兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性(Fig. 7A-C)。
    為了進(jìn)一步評估circUHRF1對anti-PD1治療耐藥的影響，建立了皮下植入circUHRF1敲低的HCCLM3細(xì)胞或陰性對照細(xì)胞的異種移植模型。結(jié)果表明注射circUHRF1敲低的HCCLM3細(xì)胞導(dǎo)致小鼠對anti-PD1治療敏感且總體生存率升高(Fig. 7D-F)。這些結(jié)果表明強(qiáng)制表達(dá)circUHRF1可能妨礙HCC對anti-PD1治療的響應(yīng)，靶向circUHRF1可能是恢復(fù)HCC對anti-PD1治療敏感性的有效方法。

圖7 在HCC患者中，高水平的circUHRF1與anti-PD1治療的耐藥性相關(guān)

    總之，本文證明HCC來源的外泌體通過誘導(dǎo)NK細(xì)胞上TIM-3的表達(dá)抑制IFN-γ和TNFα的產(chǎn)生。還報道了腫瘤外泌體通過外泌體circUHRF1抑制NK細(xì)胞功能的新機(jī)制，為HCC細(xì)胞和NK細(xì)胞的相互干擾提供了新的證據(jù)。
參考文獻(xiàn)：
Zhang Peng-Fei., Gao Chao., Huang Xiao-Yong., Lu Jia-Cheng., Guo Xiao-Jun., Shi Guo-Ming., Cai Jia-Bin., Ke Ai-Wu.(2020). Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer, 19(1), 110. doi:10.1186/s12943-020-01222-5