新突破！miR-126-5p對(duì)caspase-3的非典型抑制可通過動(dòng)脈粥樣硬化自噬對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用

    近日，一項(xiàng)刊登在國際雜志Science Translational Medicine(IF=16.304)上的文章 “The role of ferroptosis in ionizing radiation-induced cell death and tumor suppression”，來自德國慕尼黑大學(xué)等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們通過研究描述了一種miRNA分子異常不同的作用方式；研究人員表示，通過簡單地與miR-126-5p相互作用就能促進(jìn)其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并能抑制酶類caspase-3的活性，caspase-3主要會(huì)通過程序性細(xì)胞死亡的方式來殺滅細(xì)胞，以這種方式，miR-126-5p分子就能保護(hù)血管完整并減少動(dòng)脈粥樣硬化的病變的程度。

    除了通過引導(dǎo)argonaute (AGO)蛋白靶向RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)中的RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)外，尚不清楚microRNAs (miRNAs)是否也可以通過其他機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。miRNA發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后活性，miRNA需要多種成分，如高分子量RISCs中含有適配器6A (TNRC6A)的三核苷酸重復(fù)，以便miRNA與目標(biāo)mRNA的3' 端UTR'區(qū)域以及介導(dǎo)翻譯抑制或RNA衰減的酶相互作用。miRNAs可保留在與AGO2結(jié)合的低分子量復(fù)合物(LMW)中，不結(jié)合mRNA或參與靶mRNA抑制。盡管被看作是一個(gè)miRNA庫, 這些復(fù)合物是否能使宿主miRNAs蛋白相互作用，而且這些蛋白不參與典型的RISC功能。這些miRNAs是否能對(duì)蛋白質(zhì)活性發(fā)揮直接的翻譯后作用，以及這與它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)有何關(guān)系。
    LMW復(fù)合物的組裝是由哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)復(fù)合物I控制的，并且主要受mTOR抑制. mTOR的抑制是自噬最強(qiáng)大的觸發(fā)因素之一，自噬是真核細(xì)胞用來適應(yīng)應(yīng)激、維持營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)的分解過程, 用于介導(dǎo)質(zhì)量控制和受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚合體的溶酶體降解。在內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)中，自噬通量通過mTOR途徑被高剪切應(yīng)力(HSS)觸發(fā)，并在動(dòng)脈粥樣硬化的易感區(qū)域受損，但在這一背景下，層切應(yīng)力和自噬調(diào)節(jié)miRNA命運(yùn)和功能的機(jī)制尚不清楚.
    Krüppel-like家族的轉(zhuǎn)錄因子(KLFs)是自噬的重要調(diào)控因子，是控制成熟miRNA表達(dá)的miRNA加工機(jī)制的變阻器。KLF2在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中協(xié)調(diào)大部分剪切應(yīng)力誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄程序，并且是斑馬魚血流量依賴性miR-126表達(dá)所必需的。在內(nèi)皮高表達(dá)的mirna中，miR-126雙鏈有助于血管生成和血管完整性，具有特異功能和穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定。miR-126-5促血管生成和抗炎信號(hào)傳導(dǎo)，miR-126-5p維持EC增殖儲(chǔ)備，調(diào)節(jié)不同的靶點(diǎn)和通路。根據(jù)功能差異，只有miR-126-5p在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞層流中上調(diào)，以限制HSS區(qū)域的動(dòng)脈粥樣硬化(16)。盡管這兩條鏈?zhǔn)怯梢粋€(gè)共同的前體由核糖核酸內(nèi)切酶Dicer處理的，但它們的動(dòng)脈數(shù)量不受EC特異性Dicer缺失的影響。因此，miR-126鏈的差異調(diào)控并不依賴于轉(zhuǎn)錄或處理，這使得諸如剪應(yīng)力引起的自噬等潛在機(jī)制有待闡明。在本研究中，我們?cè)噲D詳細(xì)說明EC自噬在HSS上的strand特異性調(diào)控和miR-126在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，并明確鑒定了RNA結(jié)合蛋白Mex3a在miR-126-5p核富集中的作用。
    研究者Donato Santovito說道，較高的剪應(yīng)力往往會(huì)在內(nèi)皮細(xì)胞觸發(fā)一個(gè)多步驟過程，從而導(dǎo)致miR-126-5p和RNA結(jié)合蛋白之間形成分子復(fù)合體，隨后這種復(fù)合體就會(huì)被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中。一旦進(jìn)入細(xì)胞核，miR-126-5p就會(huì)被復(fù)合體釋放并與caspase-3酶結(jié)合從而抑制其活性，caspase-3自身是程序性細(xì)胞死亡的一個(gè)重要介導(dǎo)子，如今研究者知道多種因素能夠增加機(jī)體患動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡；比如血流紊亂、高水平膽固醇和高水平葡萄糖，因此，通過抑制caspase-3酶，細(xì)胞核的miR-126-5p就能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受誘導(dǎo)性的細(xì)胞死亡，此外，這樣還能減少高剪應(yīng)力部位內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷的敏感性，這的確是一種保護(hù)機(jī)體抵御動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制，因此，通過維持內(nèi)皮細(xì)胞表面的完整性，miRNA就對(duì)整個(gè)機(jī)體血管系統(tǒng)做出了重要貢獻(xiàn)。最后，研究者Weber表示，miR-126-5p迄今為止未知的功能代表了一種生物學(xué)調(diào)節(jié)原理，其能補(bǔ)充此前未被研究人員很好描述的機(jī)制，后期研究人員希望能夠通過與其他研究人員同理合作來調(diào)查是否其它miRNAs分子也能以類似的方式來發(fā)揮作用，此外，進(jìn)一步闡明這種信號(hào)通路作用的機(jī)制或?yàn)楹笃诳茖W(xué)家們開發(fā)治療心血管疾病的新型療法提供新的思路。

Figure1：klf2誘導(dǎo)的自噬引起miR-126鏈的差異調(diào)控和miR-126-5p核定位

(A)pre - miR-126、miR-126- 3p和miR-126-5p在KLF2過表達(dá)HUVECs (n = 5 ~ 7)和(B) cdh5crecreklf2fl /fl (klf2eci - ko)和對(duì)照組(野生型(WT))主動(dòng)脈內(nèi)膜中的表達(dá)(n = 4 ~ 5)。
(C) Western blot分析KLF2過表達(dá)后的自噬標(biāo)記，(D)密度測定LC3-II/LC3-I比值和p62表達(dá)(歸一化為-actin) (n = 4)。
(E)雷帕霉素和巴菲霉素處理的HUVECs中miR-126-3p和miR-126-5p的含量(n = 6)。
(F)有無雷帕霉素處理的HUVECs中miR-126-3p和miR-126-5p模擬物的代表性免疫熒光(綠色)。標(biāo)尺，5米。
(G)定量每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)模擬病灶(n = 4 ~ 5)和(H)模擬和Hoechst核染料的皮爾遜s共定位系數(shù)(n = 39 ~ 69個(gè)細(xì)胞)。
(I) 雷帕霉素處理后內(nèi)源性miR-126鏈在HUVECs中的核漿分布(n = 4)。
(J) 在接受雷帕霉素和沉默的自我吞噬病原蛋白質(zhì)(ATG5或ATG7)或cotreated importin抑制劑伊維菌素(n = 3 - 6) HUVECs中，細(xì)胞核(Nuc)和細(xì)胞質(zhì)(Cyto)中miR-126-5p的含量 (K) 在自噬速率限制蛋白(ATG5或ATG7)沉默或輸入素抑制劑伊維菌素(n = 3 ~ 6)和(K)共處理的HUVECs中細(xì)胞核(Nuc)和細(xì)胞質(zhì)(Cyto)中miR-126-5p的含量。

Fig. 2: miR-126-5p的優(yōu)先核轉(zhuǎn)移與其種子序列無關(guān)

(A) qPCR檢測經(jīng)或不經(jīng)雷帕霉素處理的HUVECs中miR-21、let-7a、miR-17和miR-126的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)數(shù)量(n = 3至4)。
(B) HUVECs中轉(zhuǎn)染miR-126-5p序列和突變體(Mut1到Mut3)。
(C)共聚焦顯微鏡顯示miR-126-5p (Nat-5p)和突變體(Mut1到Mut3，紅色)在4,6 -二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色核(灰色)中定位。
(D)定量三維反褶積和渲染后評(píng)估的突變體所占的平均核體積(n = 4至6)。

Fig. 3: 核miR-126-5p與RNA結(jié)合蛋白Mex3a和AGO2相互作用

(A)免疫熒光法檢測拉帕霉素處理的HUVECs和對(duì)照組的AGO2和LC3，并定量AGO2陽性細(xì)胞核細(xì)胞。Insets顯示同步信號(hào)(白色箭頭)(n = 5)。標(biāo)尺，20米。
(B) rapamycin處理的HUVECs中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)AGO2的RNA-IP顯示miR-126鏈負(fù)載。
(C) STED nanoscope在lc3界限的囊泡外表面顯示AGO2信號(hào)(白色箭頭)。標(biāo)尺，200nm。
(D) AGO2和Mex3a在雷帕霉素治療的HUVECs中的Co-IP。
(E) 3D共聚焦顯微鏡觀察rapamycin處理的HUVECs和對(duì)照組細(xì)胞核中的AGO2和Mex3a。標(biāo)尺，5米。
(F)修飾的納米鏡詳細(xì)描述了rapamycin治療的HUVECs中AGO2:Mex3a:LC3細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物。標(biāo)尺，1米(頂部)。兩個(gè)熒光通道(AGO2與LC3和Mex3a與LC3)在底部面板顯示復(fù)合物的放大。

Fig. 4: Mex3a優(yōu)先結(jié)合miR-126-5p來驅(qū)動(dòng)核富集

(A)在沒有miR-126-5p(摩爾比，1:2)或存在miR-126-5p(紅色)情況下，Mex3a(KH1KH2) 1H-15N HSQC光譜的覆蓋。
(B)固定miR-126-5p與全長Mex3a相互作用的SPR傳感器圖。KD = 3.6 2.9 nM。
(C)無miR-126-5p(藍(lán)色)或有miR-126-5p(紅色)時(shí)，來自Mex3a(KH1KH2)的SAXS的成對(duì)距離分布。
(D) Mex3a與miR-126-5p和miR-126-3p相互作用的估計(jì)結(jié)合親和參數(shù)表。
(E)未使用(Ctrl)和使用雷帕霉素(Rapa)處理的HUVECs核裂解液中Mex3a的RNA-IP顯示miR-126鏈負(fù)載(n = 3)。
(F) SPR傳感器圖顯示序列加載的全長重組蛋白Mex3a和AGO2 (Exp1)在固定化miR-126-5p上相互作用，反之亦然(Exp2)。
(G)全長Mex3a、miR-126-5p或其組合灌注在AGO2上的SPR檢測圖顯示，在與miR-126-5p的復(fù)合物中，Mex3a和AGO2有明顯的相互作用。
(H)有或沒有Mex3a KD的rapamycin治療的HUVECs中，miR-126-5p(灰色)的熒光原位雜交(FISH)和AGO2(綠色)和Mex3a(紅色)的典型反壓縮圖像。
(I)雷帕霉素和Mex3a沉默后HUVECs中核miR-126-5p的數(shù)量(n = 5)。

Fig. 5: 核miR-126-5p抑制細(xì)胞凋亡

(A)雷帕霉素和miR-126-5p誘導(dǎo)ec相關(guān)基因變化的Circos圖。熱圖顯示了與對(duì)照組(內(nèi))和與雷帕霉素和miR-126-5p模擬物或抑制劑(外)處理的細(xì)胞相比，雷帕霉素處理的HUVECs的相對(duì)表達(dá)。KEGG功能類別以條帶表示，(B)按褶皺富集程度排序。HIF-1，缺氧誘導(dǎo)因子1;ECM,細(xì)胞外基質(zhì);TNF，腫瘤壞死因子。
(C)對(duì)對(duì)照組和雷帕霉素處理的具有miR-126-5p的凋亡介質(zhì)進(jìn)行Western blot分析，或(D)在Mex3a KD與對(duì)照組siRNA (nc)對(duì)比后進(jìn)行細(xì)胞凋亡介質(zhì)的Western blot分析，包括標(biāo)準(zhǔn)化密度分析。PARP,保利(ADP-ribose)聚合酶。
(E)代表流式細(xì)胞儀分析和量化(F)的細(xì)胞凋亡率(膜聯(lián)蛋白V +細(xì)胞百分比)雷帕霉素治療后3小時(shí)(n = 10)和mir - 126 - 5 - p抑制(5 p異煙肼)(n = 10)或Mex3a KD (n = 10) (G)在Mex3a超表達(dá)有或沒有mir - 126 - 5 - p抑制劑(n = 7), 7-AAD 7-aminoactinomycin D;FITC,異硫氰酸熒光素。

Fig. 6: miR-126-5p與caspase-3相互作用抑制其活性

(A) miR-126-5p魚的典型反卷積圖像(紅色)和caspase-3的共免疫染色(綠色)顯示細(xì)胞核和核周圍區(qū)域的共定位信號(hào)(白色箭頭)。圖中顯示了在橙色箭頭標(biāo)記的位置上綠色和紅色通道的歸一化熒光強(qiáng)度曲線。標(biāo)尺，5米。
(B)代表deconvoluted圖像為魚mir - 126 - 5 - p和coimmunostaining caspase-3 rapamycin-treated HUVECs轉(zhuǎn)染與小干擾rna(數(shù)控siRNA)或非特異性核對(duì)抗Mex3a (Mex3a KD)和(C)皮爾森系數(shù)caspase-3和mir - 126 - 5 - p colocalization,紅線表示中位數(shù)(n = 100 - 110)。
(D) RNA-IP核和細(xì)胞質(zhì)caspase-3 mir - 126鏈加載HUVECs對(duì)待雷帕霉素(n = 6)或暴露于層流剪切應(yīng)力(高速鋼、12達(dá)因/ cm2) (n = 3)和控制(n = 9)。(E) Biotin-RNA下拉HUVECs mir - 126股轉(zhuǎn)染的顯示與Mex3a互動(dòng)和caspase-3雷帕霉素治療后。
(F)在雷帕霉素處理的HUVECs中miR-126-5p突變體和caspase-3共定位的Pearson s系數(shù)(n = 4)。紅色代表變異的核苷酸。
(G) 1H13C甲基ILVM、2h標(biāo)記的caspase-3(藍(lán)色)與miR-126-5p復(fù)合物(紅色)的二維核磁共振譜疊加，摩爾比為1:3。
(H)利用AGO2和caspase-3對(duì)固定化miR-126-5p競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)(n = 3)， IC50 = 126.9 nM。(我)Competition-binding試驗(yàn)使用caspase-3單體和mir - 126 - 5 - p (n = 3)。IC50 = 6.0 M (J)分析游離caspase-3活動(dòng)存在mir - 126 - 5 - p (Nat-5p), mir - 126 - 5 - p突變(Mut3), mir - 126 - 3 - p (Nat-3p)(4、8、16米),核糖核酸酶,caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK (DEVD),或Z-VAD-FMK(10米)(n = 3)。

Fig. 7: 刪除Atg5或Mex3a可減弱細(xì)胞核miR-126-5p-AGO2的穿梭，從而在體內(nèi)驅(qū)動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和動(dòng)脈粥樣硬化

(A) 3 d反褶積顯微鏡(B)量化LC3 +區(qū)域和(C) ECs的百分比顯示核LC3在面對(duì)主動(dòng)脈弓(低剪切應(yīng)力(LSS)]與胸主動(dòng)脈(高剪切應(yīng)力(HSS)]的載脂蛋白e /老鼠(n = 3 - 6) fed chow (CD)或高脂肪飲食(HFD) 4到12周。
(G) (D)免疫熒光和ECs的百分比顯示核AGO2 (D和E)主動(dòng)脈弓(LSS)和胸主動(dòng)脈(HSS)的載脂蛋白E /老鼠(n = 3)在HFD 12周或(F和G)人類頸動(dòng)脈標(biāo)本收集上游(HSS)和下游(LSS)的分岔(n = 7)。地區(qū)I和II (D和F)的放大了ECs的insets顯示單通道的細(xì)節(jié),沒有(我或空箭頭)和核AGO2 (II或填充箭頭)。標(biāo)尺，20米。
(H)在人類頸動(dòng)脈標(biāo)本的分叉上游(HSS)或下游(LSS，覆蓋動(dòng)脈粥樣硬化)中，共聚焦去折疊顯微鏡檢查Mex3a免疫染色，并FISH檢查經(jīng)vWF染色的ECs核中的miR-126-5p (n = 3)。標(biāo)尺，20米。
(I)定量EC核內(nèi)Mex3a與miR-126-5p的最近距離，每個(gè)區(qū)域12個(gè)視野。分布顯示了總距離和(J)相互作用代理定義的距離低于分辨率限制240納米。(K to P)對(duì)Apoe / Cdh5Cre+Atg5fl/fl (ATG5EC-KO)和Apoe / cdh5c -Atg5fl/fl WT小鼠進(jìn)行為期12周的實(shí)驗(yàn)研究。
(K)胸主動(dòng)脈顯示細(xì)胞核AGO2(免疫熒光)和(L) miR-126-5p(原位PCR)的ECs百分比(n = 3)。
(M) miR-126-5p在主動(dòng)脈弓(LSS)和胸主動(dòng)脈(HSS)中的核表達(dá)(n = 4 ~ 5)。
(N)血漿中的循環(huán)內(nèi)皮抗體(N = 8 ~ 10)。
(O)油紅色主動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)域，(P)主動(dòng)脈弓(LSS)和胸腹主動(dòng)脈(HSS)的部分貢獻(xiàn)(n = 6 ~ 9)。
(Q) C57Bl6/NCrl (WT)和Mex3a /小鼠胸主動(dòng)脈ECs顯示細(xì)胞核AGO2的百分比(n = 4)。
(R) FISH檢測WT和Mex3a /小鼠en face胸主動(dòng)脈中miR-126-5p，共免疫染色檢測caspase-3和CD31。標(biāo)尺，20米。
(S)顯示核miR-126-5p和(T) caspase-3的ECs百分比(n = 3至4)。
(U)分叉下游(LSS)或上游(HSS)人類頸動(dòng)脈標(biāo)本中顯示核miR-126-5p和caspase-3的ECs百分比(n = 3)。