MIRNA調(diào)控影響鼻咽癌惡性表型

    作為轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控子，microRNA（miRNA）調(diào)節(jié)人類三分之一以上的mRNA，進而發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控功能。研究發(fā)現(xiàn)，失調(diào)的miRNAs參與了癌癥的進展、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后。自噬是一種動態(tài)的分解代謝過程，吞噬和消化損壞細胞器和蛋白質(zhì)聚集體。自噬和miRNAs在鼻咽癌中的故事由此展開。
技術(shù)路線:

結(jié)果:
1. MIR106A-5p在鼻咽癌（NPC）中的表達及其臨床意義
    GEO數(shù)據(jù)庫篩選出NPC miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)MIR106A-5p在NPC組織中明顯增加，并通過qRT-PCR在鼻咽癌組織和NPC細胞系中確認。鼻咽癌組織原位雜交微陣列顯示在臨床IV期NPC患者中MIR106A-5p過表達顯著增多。生存率分析表明高MIR106A-5p表達患者的臨床結(jié)局比MIR106A-5p表達低的患者更壞?？傮w而言，鼻咽癌的進展是與上調(diào)的MIR106A-5p相關(guān)。

2. MIR106A-5p加速惡性NPC表型
    MIR106A-5p表達降低的NPC細胞生長和遷移能力受阻。建立荷瘤模型，發(fā)現(xiàn)MIR106A-5p的敲低顯著抑制了NPC細胞的轉(zhuǎn)移能力，小鼠注射低MIR106A-5p表達的細胞后腫瘤生長降低。以上表明，MIR106A-5p可加速NPC轉(zhuǎn)移和生長。免疫組織化學(xué)分析表明低MIR106A-5p表達的異種移植物中MAP1LC3B表達增加，MAP1LC3B表達水平與NPC異種移植物中的MKI67（增殖ki-67標記）表達負相關(guān)。

3. MIR106A-5p抑制NPC細胞自噬
    MIR106A-5p表達沉默顯著促進ATG基因表達并誘導(dǎo)自噬通量以產(chǎn)生自噬體和/或自溶酶體，表示MIR106A-5p有效抑制NPC細胞中的自噬。

4. MIR106A-5p通過抑制自噬加速NPC惡性表型
   評估MIR106A-5p抑制自噬在NPC生長和轉(zhuǎn)移中的功能，發(fā)現(xiàn)敲低ATG5明顯降低了被MIR106A-5p抑制所誘導(dǎo)的自噬。沉默MIR106A-5p表達減少了細胞活力，這種表型通過敲除ATG5得以部分挽救，MIR106A-5p海綿體內(nèi)誘導(dǎo)的生長轉(zhuǎn)移減少可被敲低ATG5所消除。這些表明MIR106A-5p抑制的自噬可加速惡性NPC表型。

5. BTG3是MIR106A-5p的直接靶標并與頭頸癌預(yù)后不良相關(guān)
   生物信息學(xué)工具來預(yù)測MIR106A-5p的自噬相關(guān)靶標，篩選出含有MIR106A-5p的潛在高親和力結(jié)合位點的BTG3（BTG抗增殖因子3）。螢光素酶報告基因檢測顯示出MIR106A-5p和BTG3 3'-UTR之間有效的相互作用，NPC中BTG3 mRNA和蛋白表達下降。MIR106A-5p抑制后，BTG3蛋白水平急劇增加，而BTG3 mRNA水平保持不變。NPC組織微陣列中MIR106A-5p表達與BTG3蛋白水平負相關(guān)。這些結(jié)果表明MIR106A-5p可能通過翻譯抑制調(diào)控BTG3表達。NPC組織微陣列的Kaplan-Meier分析揭示低BTG3水平與更差的臨床預(yù)后有關(guān)。這些數(shù)據(jù)提示MIR106A-5p通過靶向BTG3直接調(diào)節(jié)自噬。

6. MIR106A-5p抑制自噬需要BTG3
    過表達BTG3明顯增加了自噬的誘導(dǎo)，BTG3參與MIR106A-5的自噬調(diào)控效應(yīng)，BTG3的敲低消除了MIR106A-5p抑制導(dǎo)致的增強自噬能力，表明MIR106A-5p對自噬的抑制作用取決于降低BTG3水平的能力。

7. BTG3是MIR106A-5p加速惡性NPC表型的關(guān)鍵分子
    進一步證實MIR106A-5p-BTG3軸導(dǎo)致惡性腫瘤加速，發(fā)現(xiàn)MIR106A-5p抑制減少了NPC細胞的轉(zhuǎn)移和生長，但是這些影響在BTG3敲低之后大大降低，NPC異種移植組惡性表型加快自噬減少，表明自噬抑制和MIR106A-5p的促腫瘤作用需要BTG3。

8. MIR106A-5p-BTG3軸通過MAPK途徑抑制自噬
    研究通過BTG3調(diào)節(jié)自噬的機制，關(guān)注自噬相關(guān)途徑。MIR106A-5p靶基因的KEGG分析顯示MAPK和AKTMTOR通路作為自噬負調(diào)節(jié)劑出現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)僅抑制MAP2K1 / MEK活性抑制MIR106A-5p和BTG3沉默誘導(dǎo)的細胞增殖遷移。相反，通過抑制AKT活性無法更改MIR106A-5p-BTG3介導(dǎo)的腫瘤生長和遷移。探索MIR106A-5p-BTG3軸依賴的自噬抑制是否與MAPK信號激活相關(guān)。當(dāng)抑制MIR106A-5p 或BTG3表達激活自噬時，p-MAP2K1和下游p-MAPK1 /ERK和p-MTOR水平降低。在MIR106A-5p和BTG3敲低細胞中抑制MAP2K1活性后，p-MAP2K1，p-MAPK1和p-MTOR水平和ATG表達可被拯救。以上表明，在NPC中激活MAPK信號傳導(dǎo)部分負責(zé)MIR106A-5p-BTG3軸的抑制自噬。

9. NPC中的MIR106A-5p上調(diào)是由EGR1和SOX9反激活增加
    探索NPC細胞中MIR106A-5p如何上調(diào)。分析確定MIR106A-5p啟動子序列確定了EGR1和SOX9的假設(shè)結(jié)合位點。且發(fā)現(xiàn)EGR1和SOX9均在NPC細胞系中上調(diào)。沉默EGR1和SOX9表達降低MIR106A-5p水平，而過表達EGR1和SOX9增加MIR106A-5p水平。此外，螢光素酶報告基因測定和染色質(zhì)免疫沉淀分析顯示EGR1和SOX9直接結(jié)合到MIR106A-5p啟動子的預(yù)測結(jié)合位點并反激活MIR106A-5p。NPC組織中SOX9與MIR106A-5p表達呈正相關(guān)。鼻咽癌組織芯片的生存分析表明，高SOX9表達的患者預(yù)后較差。這些結(jié)果表明NPC中MIR106A-5p的過表達是由EGR1和SOX9反式激活。

參考文獻：
Zhu Q , Zhang Q , Gu M , et al. MIR106A-5p upregulation suppresses autophagy and accelerates malignant phenotype in nasopharyngeal carcinoma[J]. Autophagy, 2020(7637):1-17.