lincNMR，癌細胞增殖與衰老命運的譜寫者

    長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度不超過200nt的RNA分子，通常認為不編碼蛋白質，而是以RNA的形式在多種層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等）參與蛋白質編碼基因調控。近些年研究發(fā)現，lncRNA可以作為致癌或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望成為新型腫瘤標志物和腫瘤治療的靶點。最近，德國癌癥研究中心的Sven Diederichs教授及其團隊研究發(fā)現LincNMR通過YBX1-RRM2調控軸影響肝癌細胞活力、增殖、衰老以及體內腫瘤的形成和生長，相關研究結果以“The lncRNA lincNMR regulates nucleotide metabolism via a YBX1-RRM2 axis in cancer”為題發(fā)表在Nature Communications雜志上，雜志影響因子為12.121。

研究思路：

結果：
1.lincNMR在肝細胞癌中的作用
    作者通過TCGA數據庫篩選了9個lncRNA，并在肝細胞癌中利用siPOOLs進行基于RNAi的表型分析，通過測定肝細胞癌中ATP含量，發(fā)現轉錄本RP6-65G23.3產生了最強的細胞活力下降，可與PLK134或HULC35敲低的效果相比較，命名為lncRNA lincNMR（a）。BrdU檢測發(fā)現lincNMR沉默導致四個肝細胞癌細胞系的細胞增殖減少30%-80%（b），而lincNMR過表達挽救了因其沉默而導致的增殖減少（c）。此外，使用流式細胞儀進行細胞周期分析發(fā)現，lincNMR沉默后多個細胞系中處于細胞周期G0/G1期的細胞數量增加（d）。SA-β-GAL實驗中，β-GAL陽性藍色細胞在lincNMR缺失的細胞系的增多表明其沉默誘導細胞衰老（e，f）。以上研究結果說明lincNMR在肝癌細胞增殖過程中有重要作用。

2.lincNMR表達特征和在腫瘤生長中的作用
    進一步研究發(fā)現多種類型的腫瘤組織和正常組織中l(wèi)incNMR表達具有顯著性差異（a）。通過建立雞絨毛膜尿囊膜異種移植模型發(fā)現lincNMR沉默模型腫瘤尺寸和重量明顯小于對照組(b-d)。

3.lincNMR與YBX1的調控關系
    通過RAP和蛋白質譜分析，48個蛋白質被顯著富集，22個候選蛋白質與肝癌病人的總生存顯著相關（a,b），其中，YBX1與生存率有很強的相關性。利用RBPmap43軟件預測發(fā)現lincNMR轉錄本有3個YBX1和兩個SRSF3結合位點，且YBX1三個預測結果的第一個位點突變消除野生型lincNMR增殖挽救實驗的效果（c），UV–RIP、RT-qPCR等實驗證實lincNMR與YBX1蛋白的聯系（d），YBX1沉默細胞增殖受損50%（e）。利用熒光素酶檢測肝癌細胞株lincNNMR沉默后的YBX1活性，發(fā)現YBX1活性顯著降低（f），而YBX1過表達挽救了部分因lincNMR沉默導致的增殖損傷（g）。以上數據說明lincNMR與YBX1相互作用并調節(jié)YBX1，且YBX1模擬了lincNMR對細胞增殖的影響，而YBX1對lincNMR的調控產生了一個前饋回路作用。

4.lincNMR與YBX1的靶基因
    lincNMR沉默后，RRM2、TK1、TYMS和其他的一些核苷酸代謝途徑中的關鍵酶等蛋白表達強下調（a,b），且WB和SILAC-MS證實了RRM2、TK1和TYMS蛋白表達的降低（c,d），而YBX1缺失也誘導了RRM2、TK1和TYMS蛋白表達的顯著性降低（e,f）。

    通過siPOOLs實驗發(fā)現RRM2、TK1和TYMS的缺失顯著損害了細胞的增殖，模擬了lincNMR缺失后觀察到的表型（a），而RRM2抑制劑誘導細胞周期進程在G1期停止（lincNMR沉默效果類似）（b）。此外，YBX1、TK1或TYMS沉默顯著誘導了細胞衰老（c,d）,并顯著抑制了肝癌細胞的克隆生成能力，而RRM2缺失后，未留下任何阻止衰老或克隆生成的細胞（e,f）。以上結果說明lincNMR、YBX1、RRM2、TK1 和TYMS之間存在相互作用。

5.lincNMR/YBX1/RRM2/TK1/TYMS調控網絡
    TCGA數據庫肝癌樣本分析顯示YBX1 mRNA的表達與RRM2、TK1和TYMS mRNA表達呈顯著正相關（a-c），Chip顯示YBX1蛋白與RRM2、TK1和TYMS基因的啟動子區(qū)域相互作用（d），且熒光素酶實驗檢測到RRM2、TK1和TYMS基因的啟動子區(qū)域融合到熒光素酶，而lincNMR或YBX1沉默顯著降低了三個啟動子的熒光素酶活動（e）。以上結果進一步證明了lincNMR、YBX1、RRM2、TK1和TYMS的調控作用。

6.lincNMR缺失誘導dNTP水平降低
    由于lincNMR缺失導致dNTP合成酶下調，進一步研究了dNTPs水平是否會受到影響。通過siPOOLs沉默lincNMR發(fā)現dATP、dCTP、dGTP和dTTP顯著性下調（a,b），而YBX1沉默也導致了四種dNTPs水平降低（c,d）。通過對lincNMR沉默的細胞提供額外的dNTPs挽救了lincNMR對細胞增殖的影響（e,f）。以上結果說明核苷酸代謝在lincNMR促增殖功能中的重要作用。

7.lincNMR調控機制圖

結論：
    綜上所述，作者確定了腫瘤促進lincRNA - lincNMR，并揭示了lincNMR/YBX1-RRM2/TK1/TYMS軸調控核苷酸代謝和調控肝癌細胞增殖與衰老命運的機制。
參考文獻：
Minakshi Gandhi, Matthias Gro?, Jessica M. Holler, et al. The lncRNA lincNMR regulates nucleotide metabolism via a YBX1 - RRM2 axis in cancer. Nature Communications. 2020.