不再是焦亡：中性粒細(xì)胞中N-GSDMD新功能

    2020年5月，《Nat Commun》雜志發(fā)表“N-GSDMD trafficking to neutrophil organelles facilitates IL-1β release independently of plasma membrane pores and pyroptosis.”文章，此報(bào)道發(fā)現(xiàn)在人和小鼠中性粒細(xì)胞中卻發(fā)現(xiàn)了不一樣的結(jié)論，雖然在NLRP3炎性小體激活時(shí)仍然分泌IL-1β，但N-GSDMD并不會(huì)聚集到質(zhì)膜（PM），也不增加PM的通透性或引起焦亡。通過(guò)一系列的生化實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)膜通透性的功能分析、亞細(xì)胞組分的生化分析，以及用一種識(shí)別N-GSDMD但不識(shí)別pro-GSDMD的新型單克隆抗體對(duì)單個(gè)中性粒細(xì)胞的超分辨成像，作者發(fā)現(xiàn)炎癥激活的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的巨大差異,在中性粒細(xì)胞在中存在：1.N-GSDMD不會(huì)聚集在質(zhì)膜中成孔；2.不激活Ca2+調(diào)節(jié)的質(zhì)膜修復(fù)；3.不將N-GSDMD蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜，而是將N-GSDMD轉(zhuǎn)運(yùn)到嗜藍(lán)顆粒（azurophilic granules，易被苯胺藍(lán)染）和自噬體；4.通過(guò)自噬機(jī)制依賴的途徑釋放IL-1β。此外，N-GSDMD通透性釋放彈性蛋白酶到胞漿中，介導(dǎo)絲氨酸蛋白酶依賴的GSDMD二次斷裂。這些結(jié)果表明，N-GSDMD的動(dòng)態(tài)分布除了與質(zhì)膜結(jié)合外，還與豐富的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜結(jié)合，這些發(fā)現(xiàn)揭示了中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間GSDMD轉(zhuǎn)運(yùn)的根本差異，這是炎癥激活過(guò)程中中性粒細(xì)胞特異功能的基礎(chǔ)。

機(jī)制圖：

結(jié)果：
一、中性粒細(xì)胞中沒(méi)有漿膜GSDMD孔

    目前還沒(méi)有研究直接檢驗(yàn)N-GSDMD在黑質(zhì)素或ATP激活NLRP3炎性小體后是否會(huì)在中性粒細(xì)胞質(zhì)膜中形成氣孔。我們發(fā)現(xiàn)，正如報(bào)道的那樣，nigericin觸發(fā)了C57BL/6巨噬細(xì)胞中強(qiáng)勁的碘化丙啶(PI)內(nèi)流，而不是Gsdmd?/?巨噬細(xì)胞 (Fig. 1a, b). 活化的巨噬細(xì)胞進(jìn)行成像結(jié)果顯示甘氨酸抑制焦亡。然而，在沒(méi)有甘氨酸的情況下，nigericin可刺激C57BL/6巨噬細(xì)胞釋放LDH，而不刺激Gsdmd /巨噬細(xì)胞釋放(圖1c)。ATP觸發(fā)了類似的PI內(nèi)流和LDH釋放反應(yīng)，且是Gsdmd依賴的(補(bǔ)充圖2a c)。我們還觀察到，在nigericin刺激的人THP-1巨噬細(xì)胞中，PI被快速攝取，而在CRISPR產(chǎn)生的Gsdmd / THP-1細(xì)胞中則沒(méi)有(圖1d)。
    與巨噬細(xì)胞形成鮮明對(duì)比的是，C57BL/6小鼠在被黑質(zhì)素或ATP刺激后，骨髓中性粒細(xì)胞中PI攝取和LDH釋放均未增加(圖1e g，補(bǔ)充圖2d f)。定量流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在PI攝取上的差異(補(bǔ)充圖2g-j)。同樣，健康受試者(n = 8)在黑質(zhì)酸蛋白或ATP刺激下，經(jīng)lps誘導(dǎo)的血液中性粒細(xì)胞中也未檢測(cè)到PI的攝取(圖1h, i)和LDH的釋放(補(bǔ)充圖3a)，盡管這些刺激導(dǎo)致IL-1β分泌旺盛(補(bǔ)充圖3b)。因此，在IL-1β釋放速率高的時(shí)間點(diǎn)，小鼠和人中性粒細(xì)胞在質(zhì)膜上不會(huì)積累有功能的GSDMD孔。與Gsdmd - / -中性粒細(xì)胞相比，黑質(zhì)酸處理的C57BL/6中性粒細(xì)胞的PI積累略有增加(圖1e)可能反映了骨髓中未成熟和成熟的中性粒細(xì)胞亞群之間的異質(zhì)性，而在受刺激的人血中性粒細(xì)胞中沒(méi)有觀察到這種異質(zhì)性(圖1h)。
    針對(duì)巨噬細(xì)胞漿膜中GSDMD孔的積累，激活強(qiáng)大的Ca2+影響依賴的膜修復(fù)機(jī)制，以對(duì)抗熱腐蝕裂解。我們比較了在無(wú)Ca2+或Ca2+補(bǔ)充的培養(yǎng)基中受到黑質(zhì)酸刺激的小鼠中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的PI內(nèi)流和LDH釋放反應(yīng). 如圖1j、k所示，細(xì)胞外Ca2+的缺失(以及隨之而來(lái)的Ca2+內(nèi)流)顯著增加了nlrp3活化的巨噬細(xì)胞中PI內(nèi)流和LDH的釋放，這與IL-1釋放增強(qiáng)相關(guān)(補(bǔ)充圖4a)。相比之下，細(xì)胞外Ca2+的缺失并不促進(jìn)或改變nlrp3激活的中性粒細(xì)胞的PI通透性、LDH釋放或IL-1抑制分泌(圖1l, m，補(bǔ)充圖4b)。
    GSDMD和GSDMA3膜孔的低溫電鏡結(jié)構(gòu)顯示出與孔形成蛋白的MACPF/CDC(膜攻擊復(fù)合物穿孔蛋白樣/膽固醇依賴性溶胞素)家族成員類似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。因此，我們研究了中性粒細(xì)胞中GSDMD孔形成的缺失是否是由于其質(zhì)膜對(duì)成孔蛋白作用的內(nèi)在阻力。C57BL/6和Gsdmd?/?中性粒細(xì)胞被亞溶解濃度的肺炎鏈球菌外毒素溶肺素(Ply)刺激，后者是一種MACPF/CDC蛋白。Ply誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量PI內(nèi)流，盡管與Gsdmd?/?巨噬細(xì)胞相比，C57BL/6巨噬細(xì)胞在對(duì)Ply的反應(yīng)中表現(xiàn)出更大的PI內(nèi)流(補(bǔ)充圖5a)。我們使用NLRP3抑制劑MCC950表明，這是由于通過(guò)Ply孔的一次內(nèi)流和通過(guò)N-GSDMD孔的二次內(nèi)流的共同作用造成的。
    因此，在中性粒細(xì)胞NLRP3炎性小體激活過(guò)程中，GSDMD不會(huì)在細(xì)胞膜上形成小孔，這不是Ca2+依賴的膜修復(fù)或?qū)ACPF/ cdc樣孔形成蛋白的內(nèi)在抵抗的結(jié)果。
二、N-GSDMD不定位于中性粒細(xì)胞質(zhì)膜

    為了確定中性粒細(xì)胞中沒(méi)有質(zhì)膜GSDMD孔的機(jī)制，我們通過(guò)western blot和免疫熒光成像檢查了GSDMD的處理和N-GSDMD的定位。中性粒細(xì)胞提取物常規(guī)在補(bǔ)充了Diisopropyl Fluorophosphate (DFP)的RIPA裂解緩沖液中制備，DFP是一種對(duì)中性粒細(xì)胞顆粒中高水平存在的多種絲氨酸蛋白酶的不可逆抑制劑。通過(guò)結(jié)合全細(xì)胞裂解液和細(xì)胞外上清進(jìn)行western blot分析，我們發(fā)現(xiàn)NLRP3激活的小鼠中性粒細(xì)胞中p52 pro-GSDMD與p31 N-GSDMD的過(guò)程在定性上與小鼠巨噬細(xì)胞相似(圖2a)。但中性粒細(xì)胞中p31 N-GSDMD的積累量低于巨噬細(xì)胞。使用針對(duì)小鼠GSDMD的兩種不同抗體克隆，我們發(fā)現(xiàn)在NLRP3炎性小體激活之前，lps介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中p52前GSDMD水平相似(圖2a和補(bǔ)充圖6a);然而，與巨噬細(xì)胞相比，nlrp3激活的中性粒細(xì)胞中p31 N-GSDMD較少，這與cleaved caspase-1的產(chǎn)生減少有關(guān)(圖2a)。pan-caspase抑制劑zVAD阻斷了中性粒細(xì)胞p31 NGSDMD的Pro-GSDMD裂解(圖2b)，表明與巨噬細(xì)胞3,20一樣，中性粒細(xì)胞p31 N-GSDMD的積累依賴于caspase。
    受nigericin刺激的小鼠巨噬細(xì)胞除了產(chǎn)生p31 N-GSDMD外，還產(chǎn)生28 kDa的N-GSDMD產(chǎn)物(圖2a和補(bǔ)充圖6b)。較小的GSDMD產(chǎn)物的積累被DEVD-fmk抑制(Supplementary Fig. 6b)，表明在GSDMD裂解過(guò)程中除了caspase-1, caspase-3/7也起作用。這與caspase-1在炎性體刺激的巨噬細(xì)胞中二次激活caspase-7的報(bào)道一致21。雖然caspase-3/7可以在asps -8722位點(diǎn)切割人和小鼠的GSDMD，但在小鼠，而不是人，GSDMD也含有IPVD motif中的asps -27。caspase-1和caspase- 7聯(lián)合裂解ps -276位點(diǎn)的小鼠GSDMD，可以得到27.4 kDa的產(chǎn)物。
    我們還使用兩種不同的人GSDMD抗體，比較了GSDMD在人血中性粒細(xì)胞和人THP-1巨噬細(xì)胞中的表達(dá)和加工過(guò)程(圖2c)。H-6兔單克隆抗體(Santa Cruz)可識(shí)別proGSDMD和p31 N-GSDMD，而一種新的兔單克隆抗體(Abcam EPR20829-408)最初由Shao和同事產(chǎn)生，目前已上市，可識(shí)別人p31 N-GSDMD裂解產(chǎn)物，但不能識(shí)別pro-GSDMD。我們發(fā)現(xiàn)，H-6 Ab可以檢測(cè)到THP-1細(xì)胞和人中性粒細(xì)胞中的pro-GSDMD，而EPR20829-408不能檢測(cè)到(圖2c)， EPR20829-408在中性粒細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中均檢測(cè)到p31-N-GSDMD。盡管H6 Ab檢測(cè)到黑質(zhì)粒素刺激THP-1巨噬細(xì)胞45分鐘后proGSDMD處理接近完成，但ATPor黑質(zhì)粒素刺激的人中性粒細(xì)胞中的p31-N-GSDMD低于H6檢測(cè)閾值。因此，人和鼠中性粒細(xì)胞一樣，在NLRP3炎癥小體信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中積累p31 N-GSDMD，但其數(shù)量水平低于巨噬細(xì)胞。
    在LPS/nigericin活化的THP-1巨噬細(xì)胞中，n- gsdmd與質(zhì)膜標(biāo)記物小麥胚芽凝集素(WGA)共定位，而僅用LPS引物修飾的THP-1細(xì)胞缺乏抗n- gsdmd反應(yīng)性(圖2d, e)。
在nlrp3刺激的Gsdmd / THP-1巨噬細(xì)胞中也沒(méi)有NGSDMD染色(補(bǔ)充圖7)。
    與THP-1巨噬細(xì)胞相比，通過(guò)Imagestream分析，N-GSDMD不在nlrp3激活的人中性粒細(xì)胞的質(zhì)膜中檢測(cè)到，而是在細(xì)胞內(nèi)基因座中積累(圖2f)。共聚焦顯微鏡顯示，中性粒細(xì)胞胞漿中有離散的N-GSDMD點(diǎn)狀染色，而巨噬細(xì)胞中N-GSDMD定位于細(xì)胞表面(圖2g)。
    因此，盡管p31 N-GSDMD在caspase-1活化的人中性粒細(xì)胞中產(chǎn)生，但它并不定位于質(zhì)膜，因此也不形成有功能的細(xì)胞表面孔。相反，N-GSDMD作為指示細(xì)胞器的胞內(nèi)斑點(diǎn)積累。
三、N-GSDMD介導(dǎo)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的胞漿釋放

    我們使用生化和成像方法識(shí)別nlrp3激活的小鼠中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中N-GSDMD的亞細(xì)胞定位。用N2空化產(chǎn)生無(wú)洗滌劑細(xì)胞勻漿，并連續(xù)離心，如圖3a所示:
    (a)除去細(xì)胞核和未分裂的細(xì)胞700 g， (b) 10k g產(chǎn)生P10亞細(xì)胞器餾分，(c) 100k g分離質(zhì)膜(P100)和細(xì)胞質(zhì)(S100)。每個(gè)部分的蛋白用SDS-PAGE分解，用western blot檢測(cè)GSDMD的pro和cleaved形式。與之前的分析一致(見(jiàn)3,20)，p31-N-GSDMD在LPS/ atp刺激的巨噬細(xì)胞的P100組分中積累，并在質(zhì)膜標(biāo)記物cadherin中富集(圖3b)，在P10組分中也富集。與巨噬細(xì)胞相比，p31-N-GSDMD在LPS/ atp活化的中性粒細(xì)胞P100組分中未檢測(cè)到，但與巨噬細(xì)胞相比，N-GSDMD在S100細(xì)胞質(zhì)和P10顆粒組分中檢測(cè)到(圖3b)。在LPS/nigericin刺激的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞制備的亞細(xì)胞組分中也觀察到類似的結(jié)果(補(bǔ)充圖8a)。被LPS引物而非炎性體激活的中性粒細(xì)胞在胞漿中僅顯示全長(zhǎng)pro-GSDMD(補(bǔ)充圖8b)。在這些分離過(guò)程中，受刺激的中性粒細(xì)胞釋放成熟的IL-1和caspase-1 p20進(jìn)入細(xì)胞外培養(yǎng)基，盡管細(xì)胞膜上沒(méi)有p31 N-GSDMD(補(bǔ)充圖8c)。此外，p31 N-GSDMD被釋放到受刺激巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，但沒(méi)有中性粒細(xì)胞(Supplementary Fig. 8d)，與巨噬細(xì)胞的焦解一致，但沒(méi)有中性粒細(xì)胞。
    NLRP3激活的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的P10組分中存在p31 N-GSDMD，而非未受刺激的細(xì)胞，這與兩種細(xì)胞類型中多個(gè)胞內(nèi)細(xì)胞器標(biāo)記的存在相關(guān);其中包括線粒體(Tom-20和ATBP1)和自噬體(LC3-II)(圖3c)。然而，P10部分的中性粒細(xì)胞，而不是巨噬細(xì)胞，在嗜氮顆粒標(biāo)志物(髓過(guò)氧化物酶/ MPO和中性粒細(xì)胞彈性酶/NE)中富集。為了確定N-GSDMD是否為嗜氮顆粒，我們先用ATP刺激lps誘導(dǎo)的人血中性粒細(xì)胞45分鐘，然后用N-GSDMD選擇性EPR208209抗體和抗mpo進(jìn)行免疫染色。通過(guò)成像掃描分析(圖3d)和超分辨率成像(圖3e, f)檢測(cè)細(xì)胞。通過(guò)Imagestream分析檢測(cè)代表性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)N-GSDMD和MPO點(diǎn)狀染色(圖3d);然而，這種關(guān)聯(lián)在超分辨率圖像中更為明顯，顯示在25 75%的N-GSDMD斑點(diǎn)中N-GSDMD與MPO (<50 nm)接近(圖3e, f)。我們?cè)贚PS/ATP刺激下分離C57BL/6和Gsdmd /小鼠的骨髓中性粒細(xì)胞，分離無(wú)器官的S100細(xì)胞質(zhì)部分，并通過(guò)western blot檢測(cè)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)。我們發(fā)現(xiàn)，NE在C57BL/6中性粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中隨時(shí)間積累，而在Gsdmd /中性粒細(xì)胞中不積累(圖3g)。
四、N-GSDMD在中性粒細(xì)胞中定位為L(zhǎng)C3+自噬體

    我們比較NLRP3 inflammasome-mediated生產(chǎn)和釋放il - 1β分泌在初級(jí)中性粒細(xì)胞從控制鼠標(biāo)應(yīng)變表達(dá)ATG7液氧軌跡(Atg7f / f)與中性粒細(xì)胞從老鼠myeloid-specific刪除ATG7派生與LysMCre穿越后小鼠(Atg7MΔ)27。Nigericin——或者ATPstimulated il - 1β釋放顯著減少Atg7MΔ中性粒細(xì)胞相對(duì)于Atg7f / f中性粒細(xì)胞(圖4),水平的pro-IL-1β,proGSDMD p31-N-GSDMD發(fā)現(xiàn)Atg7f / f和Atg7MΔ中性粒細(xì)胞溶解產(chǎn)物(圖4 b)。
    ASC寡聚化和caspase-1處理也相同的刺激Atg7f / f和Atg7MΔ中性粒細(xì)胞(補(bǔ)充圖12)。因此，ATG7在IL-1釋放中的作用是在NLRP3炎癥小體組裝和caspase-1前IL-1的下調(diào)的下游。與中性粒細(xì)胞,沒(méi)有差別在il - 1β分泌Atg7f / f和Atg7MΔNLRP3刺激中巨噬細(xì)胞完整的氨基酸培養(yǎng)基后食道(圖4 c)。
    降低il - 1β的中性粒細(xì)胞釋放Atg7MΔ小鼠擬表型觀察到的響應(yīng)從Gsdmd /小鼠中性粒細(xì)胞。在典型炎性小體激活后IL-1抑制分泌，細(xì)胞內(nèi)保留p17 IL-1抑制物，而IL-1前總細(xì)胞積累或活性caspase-1的生成沒(méi)有差異(圖4d, e)。

    為了確定N-GSDMD是否與中性粒細(xì)胞自噬體相關(guān)，我們將LPS/ atp刺激的人中性粒細(xì)胞與N-GSDMD抗體和LC3共染色，用于單細(xì)胞成像和超分辨率顯微鏡觀察。我們通過(guò)Imagestream檢測(cè)N-GSDMD與LC3斑點(diǎn)的重疊(圖5a)，風(fēng)暴成像顯示約25%的N-GSDMD斑點(diǎn)與LC3非常接近(50 nm)(圖5b, c)。
    3個(gè)代表性細(xì)胞LC3+/N-GSDMD+小泡的高亮區(qū)域與N-GSDMD整合到自噬體膜一致(圖5b，右面板)。

    為了進(jìn)一步研究自噬是否在中性粒細(xì)胞分泌IL-1的過(guò)程中發(fā)揮作用，我們使用Hsp90抑制劑格爾達(dá)霉素抑制貨物裝載進(jìn)入自噬機(jī)制。Schekman和他的同事在自噬輔助IL-1分泌的HEK293細(xì)胞工程模型中證明，格爾達(dá)那霉素阻斷了Hsp90伴侶輔助的成熟IL-1細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬小體囊膜中間產(chǎn)物。
    在LPS啟動(dòng)后，在nigericin或ATP激活NLRP3之前，12個(gè)供體外周血的人中性粒細(xì)胞和小鼠中性粒細(xì)胞被格爾達(dá)那霉素孵育。每個(gè)人供體的格爾達(dá)那霉素處理的中性粒細(xì)胞IL- 1分泌均受到顯著抑制(圖6a)，其抑制不是由于細(xì)胞活力受損，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的ER-Golgi途徑對(duì)CXCL8/IL-8的分泌沒(méi)有影響(圖6b)。
    與對(duì)照組相比，格爾達(dá)霉素處理的小鼠中性粒細(xì)胞釋放的IL-1蛋白也明顯減少，而CXCL2的分泌沒(méi)有受到抑制(圖6c, d)。
    此外，在nlrp3激活的小鼠中性粒細(xì)胞中，格爾達(dá)霉素處理沒(méi)有抑制ASC寡聚、caspase-1處理或GSDMD裂解(圖6e)，表明N-GSDMD作用于炎性小體組裝和caspase-1激活的下游，從而抑制IL-1的出口。