Bmi-1與胃癌進(jìn)展

    我們先前報(bào)道了Bmi-1與Raf激酶抑制蛋白（RKIP）之間的反向關(guān)系，這與胃癌（GC）的預(yù)后有關(guān)。今天小編為大家?guī)?lái)發(fā)表于“molecular cancer”上的文章“Bmi-1-induced miR-27a and miR-155 promote tumor metastasis and chemoresistance by targeting RKIP in gastric cancer”，向大家介紹Bmi-1調(diào)控胃癌發(fā)展的機(jī)制。

    在本研究中，我們首先進(jìn)行微陣列分析以確定在Bmi-1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA譜。然后，鑒定出能夠調(diào)控RKIP的miRNA，通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)Bmi-1、miR-155、miR-27a和RKIP的表達(dá)，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR和Western blot證實(shí)了RKIP是miR-27a和miR-155的靶點(diǎn)。最后，我們研究了Bmi-1/miR-27a/RKIP和Bmi-1/miR-155/RKIP軸對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲、集落形成能力、轉(zhuǎn)移和耐藥的影響。
結(jié)果：
1.候選miRNA可能受Bmi-1表達(dá)的影響
    為了確定miRNAs是否參與了Bmi-1抑制RKIP，我們比較了Bmi-1異位表達(dá)（GES-1-Bmi-1）的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞（GES-1）的miRNA表達(dá)譜。微陣列分析表明GES-1-Bmi-1細(xì)胞（圖1a）中有51個(gè)上調(diào)和72個(gè)下調(diào)的miRNAs，包括miR-27a、miR-155和miR-516。在所有差異上調(diào)的miRNAs中，miR-27a、miR-761、miR-155、miR-4725、miR-4784、miR-4329、miR-4765和miR516b被預(yù)測(cè)為靶向RKIP（圖1b）。我們選擇miR-27a和miR-155，并通過(guò)qRT-PCR證實(shí)它們?cè)贕ES-Bmi-1細(xì)胞中上調(diào)（圖1c）。當(dāng)Bmi-1基因在BGC823和SGC7901 GC細(xì)胞系中被敲除時(shí)，miR-27a和miR-155被下調(diào)（圖1d）。
    接著，為了探討B(tài)mi-1、miR-27a、miR-155和RKIP在GC中的臨床意義，我們首先用qRT-PCR分析了它們的RNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在GC組織中Bmi-1、miR-27a和miR-155表達(dá)較高，而RKIP表達(dá)較低（圖1e）。此外，Bmi-1、miR-27a和miR-155高表達(dá)和RKIP低表達(dá)的患者在腸型GC中的3年總生存率較短。上述四項(xiàng)指標(biāo)與彌散型胃癌的3年總生存率無(wú)顯著相關(guān)性（圖1f）。綜上所述，我們的結(jié)果顯示Bmi-1、miR-27a和miR-155在GC中升高，與GC預(yù)后不良有關(guān)，而RKIP在GC中的表達(dá)水平較低，與預(yù)后良好相關(guān)。

2.miR-27a和miR-155負(fù)調(diào)控RKIP的表達(dá)
    如圖2a和b所示，miR-27a和miR-155顯著降低含有RKIP 3'UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性。此外，RNA EMSAs證實(shí)miR-27a與其同源的RKIP靶序列直接相互作用，但miR155沒(méi)有觀察到這種相互作用。如圖2c所示，miR-27a及其同源的RKIP mRNA寡核苷酸可結(jié)合在一起形成穩(wěn)定的miRNA/mRNA復(fù)合物。然而，miR-155在不同的遷移率下顯示出兩條帶，表明miR-155沒(méi)有與RKIP mRNA的寡核苷酸結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物（圖2d）。此外，miR-27a/RKIP mRNA復(fù)合物能夠與SGC7901細(xì)胞質(zhì)提取物相互作用，形成新的復(fù)合物（圖2e）。為了探討miR-27a和miR-155在RKIP表達(dá)中的作用，在轉(zhuǎn)染miR-27a模擬物/抑制劑或miR-155模擬物/抑制劑后，對(duì)BGC823和SGC7901 GC細(xì)胞進(jìn)行了Western blot分析和相應(yīng)的密度分析。結(jié)果表明，miR-27a和miR-155模擬組的RKIP蛋白表達(dá)降低，而miR-27a和miR-155抑制劑組的表達(dá)增加與（圖2f）。然而，轉(zhuǎn)染miRNAs后RKIP的RNA表達(dá)沒(méi)有改變（圖2g）。

3.Bmi-1通過(guò)miR-27a和miR-155調(diào)控RKIP的表達(dá)
    為了證實(shí)Bmi-1對(duì)RKIP的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)miR-27a和miR-155介導(dǎo)的，我們將miR-27a抑制劑和miR-155抑制劑引入GC細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染Bmi-1后，BGC823和SGC7901細(xì)胞中RKIP的蛋白表達(dá)顯著降低，但miR-27a和miR-155抑制劑都能恢復(fù)RKIP的表達(dá)。與此相反，在轉(zhuǎn)染siBmi-1后，RKIP在BGC823和SGC7901細(xì)胞顯著增加，miR-27a模擬物和miR-155模擬物抑制了RKIP表達(dá)（圖3a）。此外，轉(zhuǎn)染miRNAs或siBmi-1后，RKIP的RNA表達(dá)沒(méi)有改變（圖3b）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明RKIP的表達(dá)受到Bmi-1通過(guò)miR-27a和miR-155的負(fù)調(diào)控。

4.在體外，Bmi-1通過(guò)miR-155和miR-27a調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、侵襲、增殖和化療敏感性
    我們通過(guò)Transwell法檢測(cè)BGC823和SGC7901細(xì)胞的遷移和侵襲行為。我們發(fā)現(xiàn)，與模擬對(duì)照組相比，Bmi-1基因敲除減少了遷移和侵襲細(xì)胞的數(shù)量，而miR27a或miR-155的共轉(zhuǎn)染增加了這些細(xì)胞的數(shù)量（圖4a）。MTS實(shí)驗(yàn)表明miR-27a和miR-155的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖的增加，而B(niǎo)mi-1的下調(diào)抑制了細(xì)胞增殖，這可以通過(guò)miR-27a或miR-155的共轉(zhuǎn)染來(lái)抵消（圖4b）。菌落形成試驗(yàn)表明，與陰性對(duì)照相比，Bmi-1被抑制時(shí)，菌落形成較少。然而，miR-27a或miR-155的共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)了菌落形成能力的降低（圖4c）。接著，用MTS法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，當(dāng)使用兩種常規(guī)化療藥物治療時(shí)，Bmi -1基因敲除細(xì)胞表現(xiàn)出比對(duì)照組細(xì)胞更少的化療耐藥性。此外，為了確定Bmi-1在藥物治療過(guò)程中是否通過(guò)miR-27a或miR-155在細(xì)胞凋亡中起重要作用，我們還將miR-27a模擬物和miR-155模擬物轉(zhuǎn)染到shBmi-1細(xì)胞中。我們發(fā)現(xiàn)miR-27a和miR-155顯著減弱Bmi-1沉默對(duì)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響（圖4d）。因此，可以推斷Bmi-1通過(guò)miRNA依賴(lài)機(jī)制部分調(diào)節(jié)化療敏感性。

5.Bmi-1基因敲除通過(guò)miR-27a和miR-155抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥
    為了驗(yàn)證Bmi-1和miR-27a/ miR-155在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移定植和耐藥中的作用，將BGC823-NC模擬物、BGC823-miR-155模擬物、BGC823-miR-155模擬物、BGC823-miR-27a模擬物、BGC823-miR-27a模擬物、BGC823-shbc-1、BGC823-shBmi-1、BGC823-shcon+NC模擬物、BGC823shBmi-1+miR-155模擬物和BGC823-shBmi-1+miR27a模擬物細(xì)胞皮下或靜脈注射入裸鼠體內(nèi)。注射shBmi-1的小鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯減弱，而注射miR-155模擬物或miR-27a模擬物的小鼠則顯示相反的效果，并且腫瘤生長(zhǎng)增加（圖5a-c）。免疫組化結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖5d）。正如預(yù)期的，我們觀察到BGC823 shBmi-1組比對(duì)照組有更少的肺和肝轉(zhuǎn)移。我們還注意到，BGC823 miR-27a模擬組和BGC823-miR-155模擬組在肺和肝臟的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量都有顯著增加。此外，與BGC823shBmi-1+miR-155模擬細(xì)胞或BGC823shBmi-1+miR-27a模擬細(xì)胞相比，小鼠肺部和肝臟中的病灶數(shù)量顯著上調(diào)（圖6a-c）。
    為了評(píng)估腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，我們建立了皮下異種移植，然后評(píng)估了它們對(duì)5-Fu治療的反應(yīng)。治療14天后，處死小鼠，并腫瘤切除并稱(chēng)重。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-155模擬組和miR-27a模擬組的腫瘤明顯大于對(duì)照組，顯示出對(duì)5-Fu的耐受性（圖6d-f）。然而，與對(duì)照組相比，shBmi-1在抑制腫瘤生長(zhǎng)和提高對(duì)5-Fu的敏感性方面表現(xiàn)出明顯更強(qiáng)的作用。值得注意的是，與shBmi-1+miR-155模擬物或shBmi-1+miR-27a模擬物共轉(zhuǎn)染組的腫瘤比shBmi-1組的腫瘤生長(zhǎng)快得多，這表明miR-155模擬物和miR-27a模擬物能夠降低BGC823細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性（圖6g-i）?？偟膩?lái)說(shuō)，shBmi-1的作用可以通過(guò)miR-27a模擬物或miR-155模擬物的作用來(lái)降低RKIP的表達(dá)。

結(jié)論：
    綜上所述，本研究表明Bmi-1 通過(guò)miR-27a和miR-155對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移抑制基因RKIP產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。此外，由于Bmi-1/miR-27a/RKIP和Bmi-1/miR-155/RKIP信號(hào)軸在腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥中扮演重要角色，它們可能成為新的胃癌治療方法的有效靶點(diǎn)。