缺氧誘導的外泌體circRNA與結直腸癌的研究
缺氧是實體瘤的重要特性之一，低氧癌細胞和相對常氧的癌細胞之間存在轉移潛能的差異。環(huán)狀RNA（circRNA）是一種通過選擇性剪接形成的內源性RNA，可以穩(wěn)定地富集在外泌體中，外泌體circRNA（exo-circRNA）是在癌癥之間進行信息溝通的媒體。exo-circRNA與結直腸癌的研究值得關注。
技術路線：
結果：
1. 氧氣供應的異質性影響細胞膜上E-鈣粘著蛋白的分布
癌細胞大致分為兩組，即低氧癌細胞和常氧癌細胞。E-鈣粘蛋白（E-cadherin）在結直腸癌（CRC）細胞膜上的分布普遍呈下降趨勢，且在常氧癌細胞中比低氧細胞分布少。與缺氧外泌體共培養(yǎng)的常氧細胞跨膜的E-cadherin減少，細胞遷移能力增加。表明缺氧性外泌體可能確實攜帶促轉移信號至常氧癌細胞。缺氧外泌體處理的常氧細胞中GEF-H1 / RhoA的表達增加，下游RhoA活性相應地增加。這些結果揭示低氧外泌體刺激的常氧細胞有轉移潛能。
2. MiR-133a直接靶向GEF-H1和RhoA
生物信息學分析GEF-H1 mRNA和RhoA mRNA的3'-UTR均可由miR-133a直接靶向。螢光素酶測定發(fā)現miR-133a模擬物降低熒光素酶活性，miR-133a抑制劑增加活性。miR-133a模擬物和抑制劑不影響GEF-H1和RhoA的mRNA含量，改變蛋白水平，證實miR-133a負調控GEF-H1和RhoA的轉錄后表達。
3. circ-133和miR-133a相互作用
分離CRC患者和正常人的血漿外泌體，檢測到外泌體標志物Tsg101和CD63。CRC和NC血漿的外泌體circRNAs的差異表達，三個circRNA明顯上調，其中has_circ_0010522（circ-133）上調豐度最高，并且預期包含至少10個miR-133a結合位點。miR-133a-生物素捕獲更多的circ-133，熒光素酶證實circ-133和miR-133a之間的相互作用。CRC患者的血漿外泌體中circ-133的表達明顯增加，而miR-133a減少。隨著腫瘤疾病的發(fā)展，circ-133表達逐漸升高，而miR-133a的水平降低。circ-133在CRC組織和細胞系中過表達。來自缺氧細胞外泌體富含Circ-133，隨著缺氧時間的延長逐漸增加。
4. 缺氧性外泌體circ-133孵育正常細胞
提取的外泌體處理在常氧培養(yǎng)中的SW 480和HCT 116細胞，外泌體的PKH26染色確認外泌體可以成功融入受體細胞。circ-133在低氧外泌體培養(yǎng)的細胞中增加，而在低氧si-circ-133外泌體處理組減少，GEF-H1mRNA和RhoA mRNA水平幾乎保持恒定。低氧外泌體處理組中E-cadherin降低，而GEF-H1和RhoA的表達增加。低氧外泌體中敲低irc-133，以上變化減弱甚至消失。低氧外泌體治療組RhoA激活增加，低氧si-circ-133外泌體中激活受阻。
5. 缺氧性外泌體circ-133通過靶向GEF-H1 / RhoA促進腫瘤轉移
細胞用低氧外泌體處理，其運動、遷移侵襲能力增強，但消除缺氧性外泌體的circ-133后這種現象消失。缺氧性外泌體來源的circ-133減少了E-cadherin在細胞膜上的分布。
6. circ-133通過miR-133a / GEF-H1 / RhoA軸促進細胞遷移
細胞過表達circ-133后運動、遷移侵襲增強，而si-circ-133組減少。細胞中circ-133的水平與E-cadherin膜分布負相關。過表達circ-133細胞中GEF-H1和RhoA上調，E-cadherin減少。以上結果表明，缺氧細胞源性外泌體circ-133轉入常氧細胞，然后通過吸附miR-133a靶向GEF-H1 / RhoA，從而減少E-cadherin在細胞膜上的分布，增強癌癥的遷移能力。
7. 體內實驗證實低氧驅動的circ-133 / GEF-H1 / RhoA軸促進腫瘤進展
HCT116細胞皮下接種到SCID小鼠中，Exosomal-OE.circ-133或Exosomal-KD.circ-133每三天注射一次到尾靜脈，檢測小鼠體重和腫瘤生長。發(fā)現
OE.circ-133和OE.circ-133- KD-GEF-H1小鼠血漿外泌體和異種移植組織中circ-133明顯增加，而在KD.circ-133組下降。OE.circ-133組和OE.GEF-H1組CTC數明顯增加，下調circ-133后CTC數相應減少。OE.circ-133組E-cadherin膜分布減少，circ-133 / GEF-H1 / RhoA軸被抑制分布恢復?？偠灾脱跬饷隗wcirc-133可通過GEF-H1 / RhoA軸促進癌癥轉移。
