缺氧誘導(dǎo)的外泌體circRNA與結(jié)直腸癌的研究

    缺氧是實體瘤的重要特性之一，低氧癌細(xì)胞和相對常氧的癌細(xì)胞之間存在轉(zhuǎn)移潛能的差異。環(huán)狀RNA（circRNA）是一種通過選擇性剪接形成的內(nèi)源性RNA，可以穩(wěn)定地富集在外泌體中，外泌體circRNA（exo-circRNA）是在癌癥之間進行信息溝通的媒體。exo-circRNA與結(jié)直腸癌的研究值得關(guān)注。

技術(shù)路線：

結(jié)果：
1. 氧氣供應(yīng)的異質(zhì)性影響細(xì)胞膜上E-鈣粘著蛋白的分布
    癌細(xì)胞大致分為兩組，即低氧癌細(xì)胞和常氧癌細(xì)胞。E-鈣粘蛋白（E-cadherin）在結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞膜上的分布普遍呈下降趨勢，且在常氧癌細(xì)胞中比低氧細(xì)胞分布少。與缺氧外泌體共培養(yǎng)的常氧細(xì)胞跨膜的E-cadherin減少，細(xì)胞遷移能力增加。表明缺氧性外泌體可能確實攜帶促轉(zhuǎn)移信號至常氧癌細(xì)胞。缺氧外泌體處理的常氧細(xì)胞中GEF-H1 / RhoA的表達增加，下游RhoA活性相應(yīng)地增加。這些結(jié)果揭示低氧外泌體刺激的常氧細(xì)胞有轉(zhuǎn)移潛能。

2. MiR-133a直接靶向GEF-H1和RhoA
    生物信息學(xué)分析GEF-H1 mRNA和RhoA mRNA的3'-UTR均可由miR-133a直接靶向。螢光素酶測定發(fā)現(xiàn)miR-133a模擬物降低熒光素酶活性，miR-133a抑制劑增加活性。miR-133a模擬物和抑制劑不影響GEF-H1和RhoA的mRNA含量，改變蛋白水平，證實miR-133a負(fù)調(diào)控GEF-H1和RhoA的轉(zhuǎn)錄后表達。

3. circ-133和miR-133a相互作用
    分離CRC患者和正常人的血漿外泌體，檢測到外泌體標(biāo)志物Tsg101和CD63。CRC和NC血漿的外泌體circRNAs的差異表達，三個circRNA明顯上調(diào)，其中has_circ_0010522（circ-133）上調(diào)豐度最高，并且預(yù)期包含至少10個miR-133a結(jié)合位點。miR-133a-生物素捕獲更多的circ-133，熒光素酶證實circ-133和miR-133a之間的相互作用。CRC患者的血漿外泌體中circ-133的表達明顯增加，而miR-133a減少。隨著腫瘤疾病的發(fā)展，circ-133表達逐漸升高，而miR-133a的水平降低。circ-133在CRC組織和細(xì)胞系中過表達。來自缺氧細(xì)胞外泌體富含Circ-133，隨著缺氧時間的延長逐漸增加。

4. 缺氧性外泌體circ-133孵育正常細(xì)胞
    提取的外泌體處理在常氧培養(yǎng)中的SW 480和HCT 116細(xì)胞，外泌體的PKH26染色確認(rèn)外泌體可以成功融入受體細(xì)胞。circ-133在低氧外泌體培養(yǎng)的細(xì)胞中增加，而在低氧si-circ-133外泌體處理組減少，GEF-H1mRNA和RhoA mRNA水平幾乎保持恒定。低氧外泌體處理組中E-cadherin降低，而GEF-H1和RhoA的表達增加。低氧外泌體中敲低irc-133，以上變化減弱甚至消失。低氧外泌體治療組RhoA激活增加，低氧si-circ-133外泌體中激活受阻。

5. 缺氧性外泌體circ-133通過靶向GEF-H1 / RhoA促進腫瘤轉(zhuǎn)移
    細(xì)胞用低氧外泌體處理，其運動、遷移侵襲能力增強，但消除缺氧性外泌體的circ-133后這種現(xiàn)象消失。缺氧性外泌體來源的circ-133減少了E-cadherin在細(xì)胞膜上的分布。

6. circ-133通過miR-133a / GEF-H1 / RhoA軸促進細(xì)胞遷移
    細(xì)胞過表達circ-133后運動、遷移侵襲增強，而si-circ-133組減少。細(xì)胞中circ-133的水平與E-cadherin膜分布負(fù)相關(guān)。過表達circ-133細(xì)胞中GEF-H1和RhoA上調(diào)，E-cadherin減少。以上結(jié)果表明，缺氧細(xì)胞源性外泌體circ-133轉(zhuǎn)入常氧細(xì)胞，然后通過吸附miR-133a靶向GEF-H1 / RhoA，從而減少E-cadherin在細(xì)胞膜上的分布，增強癌癥的遷移能力。

7. 體內(nèi)實驗證實低氧驅(qū)動的circ-133 / GEF-H1 / RhoA軸促進腫瘤進展
    HCT116細(xì)胞皮下接種到SCID小鼠中，Exosomal-OE.circ-133或Exosomal-KD.circ-133每三天注射一次到尾靜脈，檢測小鼠體重和腫瘤生長。發(fā)現(xiàn)
OE.circ-133和OE.circ-133- KD-GEF-H1小鼠血漿外泌體和異種移植組織中circ-133明顯增加，而在KD.circ-133組下降。OE.circ-133組和OE.GEF-H1組CTC數(shù)明顯增加，下調(diào)circ-133后CTC數(shù)相應(yīng)減少。OE.circ-133組E-cadherin膜分布減少，circ-133 / GEF-H1 / RhoA軸被抑制分布恢復(fù)?？偠灾脱跬饷隗wcirc-133可通過GEF-H1 / RhoA軸促進癌癥轉(zhuǎn)移。