新研究揭示PD-1通路調(diào)節(jié)ILC2代謝，PD-1激動(dòng)劑治療可改善氣道高反應(yīng)性

    最近在Nature communication上線了一篇標(biāo)題為 “PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity” 的文章。該文的通訊作者是來自美國南加州大學(xué)凱克醫(yī)學(xué)院分子微生物學(xué)與免疫學(xué)學(xué)系的Omid Akbari。
    過敏性哮喘是一種與呼吸系統(tǒng)癥狀有關(guān)的慢性疾病，如呼吸短促、胸悶和咳嗽火性氣道疾病。
    近幾十年來，哮喘的流行率顯著增加，全世界約有3.39億人受到影響。因此，確定新的治療靶點(diǎn)已成為確保該病有效控制的必要。哮喘的動(dòng)物模型可以很好地用來模擬哮喘的臨床特征，主要是氣道高反應(yīng)性(AHR)，它依賴于T-helper 2 (Th2)細(xì)胞因子的分泌;白介素(IL)-5促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)入肺，而IL-13誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生和粘液生成。雖然Th2細(xì)胞被公認(rèn)為2型炎癥的關(guān)鍵控制者，但2型先天淋巴樣細(xì)胞(ILC2s)的早期激活已成為哮喘啟動(dòng)和放大的關(guān)鍵步驟.

    PD-1是B7/CD28家族成員，主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上。配體結(jié)合PD-1, PD-L1 PD-L2,緊隨其后的是一連串的胞內(nèi)信號,導(dǎo)致T細(xì)胞抑制和疲憊,PD-1胞質(zhì)域進(jìn)行磷酸化的酪氨酸殘基,促進(jìn)招聘的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(中),主要是Src同源區(qū)域2 domain-containing phosphatase-2 (SHP-2)。這隨后導(dǎo)致細(xì)胞存活和增殖所必需的幾種激酶的去磷酸化。由于PD-1通路具有恢復(fù)T細(xì)胞功能的能力，阻斷PD-1通路已成為多種腫瘤的治療策略。目前美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)了6種PD-1途徑抑制劑，用于16種腫瘤類型。相反，PD-1缺乏與小鼠的自我耐受性改變和自身免疫性疾病有關(guān)。因此，PD-1軸作為治療各種炎癥和自身免疫性疾病的潛在治療靶點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注
技術(shù)路線：

一、PD-1在IL -33激活的ILC2中被高度誘導(dǎo)
    我們首先對PD-1在肺ILC2s上的表達(dá)進(jìn)行了表征，流式細(xì)胞術(shù)鑒定為CD45+譜系- ST2+ CD127+。在整個(gè)研究過程中，未轉(zhuǎn)染小鼠的ILC2s被定義為naive (nILC2s)， il -33轉(zhuǎn)染小鼠的ILC2s被定義為activated (aILC2s)。PD-1僅在很少的nILC2s群體中表達(dá);然而，經(jīng)鼻刺激IL-33可顯著誘導(dǎo)PD-1的表達(dá)。我們還評估了PD-L1和PD-L2在肺ilc2上的表達(dá)。PD-L1在naive和aILC2s中均高表達(dá)，而PD-L2不表達(dá)。抑制信號的產(chǎn)生和傳遞需要PD-1與其配體之間的相互作用。為了確定在我們的ilc2依賴性哮喘模型中PD-1配體的潛在來源，我們對PD-L1和PD-L2在CD45+和CD45活肺細(xì)胞上的表達(dá)進(jìn)行了表征。
    在CD45+細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)陽性群體:(i)同時(shí)表達(dá)PD-L1和PD-L2的群體，主要代表CD11b+ CD11c+細(xì)胞;(ii)僅表達(dá)PD-L1的群體，主要代表CD11b+ Gr-1+細(xì)胞。有趣的是，在IL-33誘導(dǎo)下，這兩個(gè)人群的百分比顯著增加。與此同時(shí)，CD45細(xì)胞群體也能表達(dá)和上調(diào)PD-L1的表達(dá)，以應(yīng)對IL-33。
    綜上所述，這些結(jié)果表明PD-1對ILC2s具有高度誘導(dǎo)作用，免疫和非免疫肺群體可在ILC2依賴性哮喘中提供PD-1配體來源。

二、PD-1在aILC2s中調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和存活
    PD-1在肺aILC2s中顯著表達(dá)，我們使用RNAsequencing分析比較了從野生型(WT)和PD-1敲除(KO)小鼠中經(jīng)facs分類的aILC2s的轉(zhuǎn)錄譜。有趣的是，PD-1缺失導(dǎo)致aILC2s中有840個(gè)顯著調(diào)控基因:426個(gè)基因上調(diào)，414個(gè)基因下調(diào)。
    比較了細(xì)胞因子編碼基因在中的表達(dá)。l5、Il13、Il9和Csf2在沒有PD-1的情況下高度上調(diào)(圖2b)。
    WT和PD-1 KO小鼠aILC2s培養(yǎng)24 h，定量培養(yǎng)上清細(xì)胞因子。ILC2的激活導(dǎo)致Th2細(xì)胞因子的分泌; 然而，PD-1 KO aILC2s顯示出更多的IL-5、IL-13和IL-9(圖2c e)。
    確定PD-L2是否會(huì)抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。PD-L2 Fc使IL-5和IL-13的分泌減少了約2- 3倍(圖2f, g)。
    PD-L1的組成性表達(dá)是否代表了ILC2s中功能PD-1配體的來源。在沒有PD-1配體來源，以及PD-1阻斷抗體或同型對照的情況下，用IL-33在體外刺激nILC2s。
    PD-1阻斷后，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)和IL-5的產(chǎn)生顯著增加(圖2h, i)。這些結(jié)果表明，在ILC2s中抑制了潛在的PD-1/PD-L1相互作用。
    與WT aILC2s相比，PD-1 KO中Bid、Casp2等促凋亡基因表達(dá)明顯下調(diào)，而Bcl2l1、Bag3、Mcl1等抗凋亡基因表達(dá)上調(diào)。
    AnnexinV+ DAPI和雙陽性細(xì)胞在PD-1 KO aILC2s中均顯著降低，表明細(xì)胞凋亡和死亡減少(圖2k m)。
    流式細(xì)胞儀檢測凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)。PD-1 KO aILC2s中Bcl-2的表達(dá)顯著且高于WT aILC2s(圖2n, o)。
    綜上所述，這些結(jié)果表明PD-1軸積極參與ILC2存活的調(diào)控。

三、PD-1的缺乏增強(qiáng)了aILC2s的糖酵解代謝
    有氧糖酵解被認(rèn)為是T細(xì)胞激活和增殖的標(biāo)志。雖然氨基酸和需氧糖酵解可能對ILC2s31至關(guān)重要，但I(xiàn)LC2代謝似乎更依賴于脂肪酸(FA)。
    PD-1缺陷導(dǎo)致糖酵解基因(如Hk1、Pkm和G6pdx)顯著上調(diào)，以及FA代謝相關(guān)基因的下調(diào)。PD-1 KO aILC2s中谷氨酰胺依賴基因也被上調(diào)(圖3a)。
    用熒光葡萄糖模擬物2- NBDG和流式細(xì)胞術(shù)來測量活細(xì)胞中葡萄糖摻入的程度。根據(jù)轉(zhuǎn)錄分析，在aILC2s中，PD-1缺失導(dǎo)致葡萄糖攝取增加，提示葡萄糖代謝差異和葡萄糖消耗增加(圖3b)。
    PD-1 KO ILC2s與WT ILC2s相比，在IL-33的作用下，主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體glut1的表達(dá)上調(diào)(Supplementary Fig. 2B)。
    代謝組學(xué)進(jìn)一步用于評估PD-1缺乏對代謝產(chǎn)物的影響。PD-1 KO aILC2s與WT aILC2s相比，糖酵解和磷酸戊糖途徑的代謝物水平顯著升高。這些代謝物包括磷酸甘油酸、磷酸正丁糖、磷酸戊糖和磷酸己糖(圖3c f)。
    為了證實(shí)不同的2-NBDG攝取和代謝組學(xué)結(jié)果反映了糖酵解代謝的功能差異，我們測量了耗氧率(OCR)、氧化磷酸化反應(yīng)(OXPHOS)和細(xì)胞外酸化率(ECAR)。PD-1 KO aILC2s表現(xiàn)出備用呼吸能力的下降，說明PD-1的缺乏觸發(fā)了從OXPHOS到有氧糖酵解的轉(zhuǎn)換(圖3g)。
    在這種情況下，葡萄糖發(fā)酵成乳酸，而不是氧化線粒體由于高能量需求。此外，PD-1 KO的細(xì)胞能量表型分析顯示ECAR大于WT aILC2s，這意味著在最大呼吸時(shí)OCR/ECAR比值較低，糖酵解能力較高(圖3h, i)。
    這些結(jié)果共同揭示了PD-1缺乏與aILC2s中葡萄糖需求增加相關(guān)，促使代謝顯著向糖酵解方向轉(zhuǎn)變

四、PD-1抑制aILC2s中蛋氨酸和谷氨酰胺分解代謝
    氨基酸分解代謝產(chǎn)生蛋白質(zhì)合成的代謝物，但也可以作為信號分子控制免疫細(xì)胞生長、核苷酸合成、氧化還原控制和許多其他功能35。我們的代謝組學(xué)分析顯示PD-1的缺乏通常會(huì)改變aILC2s的代謝活性。特別是，與嘧啶和嘌呤合成有關(guān)的中間代謝物，如5 -二磷酸腺苷(ADP)和腺嘌呤，以及甲基化有關(guān)的中間代謝物的上調(diào)(圖4a)。
    第一個(gè)途徑是蛋氨酸途徑(圖4b)。兩個(gè)重要中間代謝物的相對量蛋氨酸代謝,S-Adenosylmethionine (SAM)和SAdenosylhomocysteine (SAH),在PD-1 KO aILC2s顯著增加(圖。4 c, d)。
    兩端蛋氨酸代謝產(chǎn)物的分解代謝,谷胱甘肽和牛磺酸,表現(xiàn)出更高的相對量PD-1 KO aILC2s WT aILC2s相比(圖4 e, f)。
    在篩選的途徑中，谷氨酰胺分解也受到影響(圖4g)。谷氨酰胺的消耗是關(guān)鍵的免疫細(xì)胞代謝，特別是淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的生產(chǎn)。
    PD-1的缺乏增加了谷氨酰胺代謝中幾個(gè)中間產(chǎn)物和末端代謝物的相對水平，如谷氨酸、n -甲基谷氨酸、n -乙酰谷氨酸(NAG)和鳥氨酸(圖4h k)。
    與WT aILC2s相比，只有GABA的相對含量在PD-1 KO中顯著降低(圖4l)。
    綜上所述，這些結(jié)果表明PD-1缺乏增強(qiáng)了aILC2s的氨基酸分解代謝，特別是依賴蛋氨酸和谷氨酰胺的代謝途徑。

五、PD-1通過代謝調(diào)控抑制aILC2的增殖。
    PD-1缺陷上調(diào)了Th2分化信號通路的相關(guān)基因，包括Gata-3、Junb、Stat5a和Stat6，下調(diào)了參與Th1分化和激活的基因，如Irf1和Stat1(圖5a)。
    根據(jù)這些結(jié)果，通過流式細(xì)胞儀檢測，缺乏PD-1的aILC2s中，GATA-3的表達(dá)強(qiáng)度更高(圖5b)。
    Ki67核內(nèi)染色顯示，在沒有PD-1的情況下，活的aILC2s具有高度增殖能力(圖5c)。為了評估PD-1 KO ILC2s的代謝轉(zhuǎn)移與增殖之間的因果關(guān)系，我們分別使用競爭性抑制劑2-deoxy-d-glucose (2-DG)和cycloleucine (CYL)抑制糖酵解和蛋氨酸分解代謝。2-DG形成不能進(jìn)行進(jìn)一步糖酵解的2-DG-6- p，而CYL抑制催化蛋氨酸轉(zhuǎn)化為SAM的蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT)(圖5d)。
    相對較低濃度的這些抑制劑足以顯著降低PD-1 KO aILC2s中GATA-3的表達(dá)和增殖，而對WT aILC2s的影響較弱或不顯著(圖5e, f)。
    為了將我們之前的觀察結(jié)果與背景相結(jié)合，我們研究了體內(nèi)糖酵解抑制對aILC2s的影響。如圖5g所示，在經(jīng)鼻注射IL-33的同時(shí)，腹腔注射抑制劑2-DG。
    PD-1 KO小鼠肺部ILC2s數(shù)量高于WT小鼠。有趣的是，在PD-1 KO小鼠中，2-DG顯著降低了ILC2百分比(CD45+，細(xì)胞系細(xì)胞)和絕對計(jì)數(shù)，但在WT小鼠中沒有(圖5h, i)。
    符合這些結(jié)果,2 dg治療導(dǎo)致明顯降低GATA-3 PD-1 KO肺aILC2s Ki67的表情,雖然很弱影響WT aILC2s(圖5 j, k)。
    綜上所述,體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,PD-1不足與對糖酵解代謝轉(zhuǎn)變,從而提高ILC2活化和增殖潛力IL-33-induced哮喘

六、ILC2s上PD-1的表達(dá)可改善AHR和肺部炎癥
    在最后一次鼻內(nèi)刺激一天后，使用FinePointe RC系統(tǒng)(Buxco Research Systems)對麻醉的氣管造口小鼠的肺阻力和動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(cDyn)進(jìn)行直接測量，然后進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)和肺組織樣本分析(圖6a)。
    經(jīng)鼻給予IL-33可顯著增加WT和PD-1 KO小鼠的肺抵抗;然而，il -33處理的PD-1 KO小鼠的肺抵抗力明顯高于il -33處理的WT小鼠(圖6b)。與肺阻力一致的是，il -33處理的PD-1 KO的動(dòng)態(tài)順應(yīng)性結(jié)果顯示，與il -33處理的WT小鼠相比，其響應(yīng)更低(圖6c)。
    PD-1是il -33誘導(dǎo)的AHR的負(fù)調(diào)控因子。雖然IL-33處理顯著誘導(dǎo)WT和PD-1 KO小鼠BAL嗜酸性粒細(xì)胞增多，但I(xiàn)L-33處理的PD-1 KO小鼠的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯高于WT小鼠(圖)。6 d)。
    同樣，在IL-33刺激后，PD-1 KO小鼠的肺中ILC2s的數(shù)量更高，甚至在幼稚小鼠中，IL-5+ IL-13+ ILC2s的數(shù)量也更高(圖6e, f)。
    第5天測定AHR、BAL嗜酸性粒細(xì)胞和肺ILC2值(圖6g)。
    與對照組相比，抗pd -1處理的Rag2 /小鼠在增加乙酰膽堿濃度、降低動(dòng)態(tài)順應(yīng)性、更高的嗜酸性粒細(xì)胞招募和更高的肺ILC2數(shù)量方面表現(xiàn)出更大的肺抵抗(圖6h k)。

七、PD-1激動(dòng)劑降低人源化小鼠的ilc2依賴性AHR。
    由于PD-1在自身免疫性疾病和我們的哮喘模型中發(fā)揮有益的調(diào)節(jié)作用，我們開發(fā)了一種人類PD-1激動(dòng)劑，用于靶向AHR中的PD-1+ILC2s。人類ILC2s被鑒定為CD45+譜系CD127+ CRTH2+(圖7a)。
    首先，我們觀察到PD-1在重組人(rh)- IL-2和rh- il -7培養(yǎng)的人ILC2s上表達(dá)，并對rh- il33產(chǎn)生重要的誘導(dǎo)反應(yīng)(圖7b)。
    體外檢測了PD-1激動(dòng)劑對人ILC2s產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子的影響。有趣的是，與同型相比，PD-1激動(dòng)劑強(qiáng)烈抑制了IL-5和IL-13的產(chǎn)生(圖7c, d)。
    在最后三天內(nèi)，用PBS或rh-IL-33對小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)刺激以誘導(dǎo)AHR(圖7e)。
    值得注意的是，PD-1激動(dòng)劑處理的小鼠與同型處理的小鼠相比，肺抵抗顯著降低(圖7f)。
    與肺抵抗一致，PD-1激動(dòng)劑治療小鼠的動(dòng)態(tài)順應(yīng)性表現(xiàn)出更高的反應(yīng)(圖7g)
    激動(dòng)劑處理的小鼠肺部炎癥消失，人類ILC2s數(shù)量減少，嗜酸性粒細(xì)胞減少，氣道上皮厚度減少(圖7h m)。
    總的來說，這些研究首次證實(shí)PD-1的激動(dòng)性激活抑制了IL-33和hdm誘導(dǎo)的哮喘模型中的AHR，并為哮喘性過敏提供了一種新的特異性治療方法。