驚呆你的騷操作——人尿來源外泌體保護腎臟缺血/再灌注損傷

    缺血/再灌注損傷（IRI）是急性腎損傷（AKI）的主要原因，與高發(fā)病率和高死亡率相關，缺乏專門的治療方法。在這項研究中，調查了人類尿液來源干細胞（hUSCs）及其外泌體對IRI誘導的AKI的保護作用，以探索這些細胞作為新治療策略的潛力。本文發(fā)表在Theranostics（IF:8.579）的2020年1021卷。
技術路線：

主要實驗結果：
1、分離鑒定hUSCs
    如圖1所示，從人類尿液樣本中分離出細胞培養(yǎng)3-5天，觀察到微小的紡錘狀細胞集落，并能在體外迅速增殖，流式，WB和qRT-PCR檢測了其表面分子的表達，包括OCT4和NANOG。

圖1人類尿液來源干細胞的特性

2、在腎IRI模型中，USCs可減少腎小管損傷和細胞凋亡，抑制局部炎癥
    與對照組相比，USC處理顯著提高大鼠生存期，注射USCs后第3天sCr和BUN水平降低，第7天腎臟損傷病理評分降低。

圖2 腎IRI后USCs對腎功能的保護作用

    隨后，作者檢測了USC處理的IRI小鼠模型腎臟細胞的凋亡，和炎癥因子的表達情況，如圖3所示，USC處理后細胞凋亡顯著減少，炎癥細胞的浸潤顯著下降，細胞的氧化應激水平也明顯受到抑制。

圖3 USCs降低IRI后腎臟凋亡相關蛋白表達、炎癥細胞浸潤和氧化應激水平

3、USC-Exo在體內對IRI有保護作用，在體外對H/R損傷后的HK-2細胞氧化應激有抑制作用
    為了探究USC處理對小鼠的保護作用是否通過外泌體發(fā)揮作用，作者從USC中提取了外泌體樣本，如圖4A所示。隨后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，USC來源外泌體（USC-Exo）處理組顯著提高了小鼠生存期，sCr和BUN水平降低。在體外H/R損傷后，使用USC-Exo處理組的HK2細胞的焦亡和炎癥分子的表達顯著下降，表明USC-Exo對HK2有保護作用。

圖4 USC-Exo在體內對腎功能有保護作用，在體外對H/R損傷后的HK2細胞有保護作用

4、在USC-Exo中，miR-146a-5p抑制IRAK1的表達
    為了進一步探究USC-Exo的作用機制，作者進行了外泌體RNA測序，從而鑒定到20個候選的miRNA，其表達如圖5A所示，挑選表達豐度最高的6個做了qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)只有miR-146a-5p顯著高表達。隨后，進行了熒光素酶實驗，結果顯示miR-146a-5p與IRAK1具有物理結合作用。

圖5 USC-Exo含量的miRNA測序及miR-146a-5p的潛在靶點

5、在體內和體外USC增強miR-146a-5p的表達和抑制IRAK1表達和NF -κB p65亞基的核異位
    為了進一步證實miR-146a-5p對于USC在IRI中的保護作用至關重要的假設，首先確定了USR治療的IRI大鼠腎臟組織中miR-146a-5p的表達水平。 qRT-PCR分析顯示，USC治療的IRI組的腎臟中miR-146a-5p表達上調（圖6A）。為了進一步確定USC分泌的miR-146a-5p是否通過外泌體遞送到受損的腎臟組織，在USC處理后第3天從大鼠收集血清樣品，提取外泌體，并檢測miR-146a-5p的表達水平。結果顯示與對照組比，外泌體miR-146a-5p在經USC治療的血清組中表達更高（圖6B）。FISH進一步證明了在受損的腎臟組織中miR-146a-5p表達的增加（圖6C）。IRAK1的mRNA（圖6A）和蛋白（圖6D）表達水平在USC治療的IRI大鼠的腎臟中被下調。USC-Exo處理可顯著上調miR-146a-5p表達并下調IRAK1在HK2處理細胞中的表達（圖6E）。與體內觀察結果一致，WB顯示，USC-Exo處理后IRAK1蛋白表達以及NF-κB p65亞基的核易位均降低（圖6F）。進一步在USC-Exo處理的細胞中對NF-κB p65進行了染色，發(fā)現(xiàn)在H / R后的對照HK2細胞中，NF-κB p65位于細胞核中。相反，在H / R后經USC-Exo處理的HK2細胞中，一些NF-κB p65保留在細胞質中，其核定位水平顯著降低（圖6G）。這些結果表明，USC對腎損傷的保護作用可能是通過外泌體miR-146a-5p介導的NF-κB信號下調而發(fā)生的。

圖6 USC或USC-Exo上調miR-146-5p表達抑制IRAK1和NF -κB信號體內和體外

6、針對H / R HK2細胞miR-146-5p抑制IRAK1表達式和NF -κB p65核易位
    接下來在體外使用H / R誘導的損傷模型描述miR-146a-5p和IRAK1之間的調控關系。用miR-146a-5p轉染HK2細胞，并通過qRT-PCR證實了miR-146a-5p表達增加（圖7A）。轉染的細胞同時受到H / R損傷，qRT-PCR分析顯示miR-146a-5p導致IRAK1 mRNA表達顯著降低（圖7A）。此外，用miR-146a-5p可以減少氧化應激，增加SOD活性，并降低MDA含量（圖7B）。WB表明，miR-146a-5p導致IRAK1蛋白表達和NF-κB p65亞基核易位顯著降低（圖7C）。免疫熒光染色顯示miR-146a-5p可以減少NF-κB p65的核定位（圖7D）。而用miRNA抑制劑處理HK2細胞，發(fā)現(xiàn)抑制劑治療組IRAK1的表達水平高于對照組（圖7E）。 miR-146a-5p抑制劑可加重氧化應激，降低SOD活性，并增加MDA含量（圖7F-G）。這些結果共同表明，miR-146a-5p在H / R誘導的損傷中調控IRAK1表達和NF-κBp65亞基核易位中具有不可或缺的作用。

圖7 miR-146-5p減少氧化應激，抑制IRAK1，NF -κB信號在H/R-induced HK2細胞的損傷

    總而言之，本文證明了USC通過抗氧化，抗炎和抗凋亡細胞保護作用之間的相互作用，在IRI大鼠模型中預防腎臟損傷。 此外，在體外使用H / R誘導的氧化應激細胞模型，確定了USC-Exo中的關鍵參與者miR-146a-5p，它通過下調IRAK1 /NF-κB信號傳導來介導細胞保護作用。這些發(fā)現(xiàn)為使用無創(chuàng)且經濟高效的USC或USC-Exo治療AKI提供了理論基礎。
參考文獻：
Li Xirui., Liao Jun., Su Xiaojun., Li Weiqiang., Bi Zirong., Wang Jiali., Su Qun., Huang Huiting., Wei Yongcheng., Gao Yifang., Li Jun., Liu Longshan., Wang Changxi.(2020). miR-146a-5pHuman urine-derived stem cells protect against renal ischemia/reperfusion injury in a rat model via exosomal  which targets . Theranostics, 10(21), 9561-9578. doi:10.7150/thno.42153