急性肺損傷的Mas依賴性性別差異調控
急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是臨床上十分常見的一類危重癥，是由嚴重創(chuàng)傷、休克、酸中毒或嚴重感染等多種肺內外因素引起的，病死率高達40～31%，以炎癥和血管通透性增強為特征，臨床上表現(xiàn)為進行性低氧血癥和呼吸窘迫，發(fā)展至嚴重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）。流行病學研究對ARDS的性別差異產生了矛盾的結果：幾項研究報告女性的年死亡率和住院死亡率較低，這一發(fā)現(xiàn)似乎得到了最近嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）爆發(fā)的新數據的支持，表明男性的死亡率高于女性。然而，在有風險的患者中進行的其他研究未檢測到ARDS發(fā)生率或死亡率與性別顯著相關，甚至與女性風險增加相關。
近期，科克大學的Thomas Walther教授發(fā)現(xiàn)改善肺內皮屏障功能可保護雌性小鼠免受ALI誘導的肺水腫，這種效應部分是通過雌激素依賴性Mas表達誘導Ang-(1-7)/Mas信號增強介導的，相關研究以“Estrogen-mediated upregulation of the Mas receptor contributes to sex differences in acute lung injury and lung vascular barrier regulation”為題發(fā)表在European respiratory journal雜志上，雜志影響因子為12.339。
技術路線：
結果：
1、 ARDS發(fā)生率的性別差異
作者調查了2005年到2016年在柏林大學夏麗特醫(yī)學院登記的734090名住院患者，發(fā)現(xiàn)有2475例診斷為ARDS，其中男性1553例(62.7%)，女性922例(37.3%) (p<0.05)。除了幼兒(<9年)，女性患者在所有年齡組中較少見，表明從青春期到絕經后的年齡階段女性的肺受到保護(下圖)。
通過酸灌注和高潮氣量通氣雙重打擊誘導ALI小鼠模型，發(fā)現(xiàn)雄性老鼠發(fā)生顯著肺部水腫，表現(xiàn)為濕干肺重比的增加(A)，以及明顯的血管滲漏，表現(xiàn)為支氣管肺泡灌洗液(BALF)血清總蛋白濃度明顯增加 (B)和大分子人血清白蛋白(HSA)外滲增加 (C)，這些作用與中性粒細胞的聚集有關，表現(xiàn)為髓過氧化物酶(MPO)活性的增加(D)以及肺損傷的組織學特征(E,F)。雌性小鼠中，ALI的所有特征都被歸一化(圖2A-F)，表明雌性小鼠與雄性小鼠相比具有顯著的肺保護作用。為了探索ACE2/Ang-(1-7)/Mas軸在性別特異性保護中的作用，在Mas-/-小鼠中重復上述實驗。對照組中，Mas-/-小鼠與相應的雄性和雌性野生型(WT)小鼠沒有差異(A-F)。與Mas-/-對照相比，Mas-/-雌性小鼠ALI模型中肺濕干重比和組織學肺損傷評分增加，表現(xiàn)出較少的保護作用(A,E)，并且BALF蛋白濃度和組織學評分超過了WT雌性小鼠ALI模型的相應值(B,E)。與相應的WT小鼠相比，雄性Mas-/-小鼠ALI模型中肺損傷加重并不明顯，表現(xiàn)出ALI不那么嚴重的趨勢，這種趨勢僅對血管泄漏的參數有意義(B,C)。
3、血小板活化因子對離體肺血管通透性的影響
由于Mas依賴的性別差異主要與血管滲漏和水腫形成的特征有關，與炎癥無關(MPO活性)。接下來測量了血小板活化因子(PAF)刺激后肺重量變化，發(fā)現(xiàn)PAF刺激后雄性WT小鼠的離體肺發(fā)生顯著的肺增重，經PAF刺激的雌性WT小鼠離體肺的重量無顯著增加(p<0.05)，而PAF刺激的Mas-/-雄性小鼠離體肺的肺增重低于雄性WT小鼠(A)，PAF刺激的Mas-/-雌性小鼠離體肺的肺增重加速(B)。
4、雌激素通過Mas受體穩(wěn)定培養(yǎng)內皮細胞的屏障功能
作者進一步檢測了雌激素(E2)和Ang-(1-7)/Mas之間的作用，假設其可能是雌性小鼠部分Mas依賴性屏障保護的基礎。研究分析了培養(yǎng)的人肺微血管內皮細胞(HPMECs)在凝血酶作用下的屏障功能，表現(xiàn)為跨內皮電阻(TEER)的變化 (A-C)。在融合HPMECs單層中，凝血酶刺激導致TEER在15 min內快速降低約15%，表明內皮間隙形成和內皮泄漏。用1 nmol/L E2預處理24 h，可完全阻止凝血酶的損傷作用。在凝血酶刺激前30 mi用七肽Ang-(1-7)預處理內皮細胞也達到類似的保護效果，兩種處理聯(lián)合使用導致了累加的屏障穩(wěn)定(A)。接著，使用了兩種藥理學上不同的Mas受體阻滯劑A779和D-Pro7-Ang-(1-7)，阻斷了Ang-(1-7)的保護作用(1-7) (B,C)。重要的是，這兩種拮抗劑也減弱了E2預處理的保護作用，表明雌激素至少部分是通過刺激Ang-(1-7)/Mas軸發(fā)揮作用的。
5、ALI模型中ACE2/Ang-(1-7)/Mas軸的性別特異性調控
為了探索ACE2/Ang-(1-7)/Mas軸的性別差異調控，作者通過熒光測量了雄性和雌性小鼠肺中兩種關鍵酶ACE和ACE2的活性。ACE活性在雄性和雌性WT小鼠肺之間沒有差異，在對照組和ALI之間也沒有差異(A)。ACE2活性在ALI的肺中明顯下降，但沒有性別特異性差異(B)。接著，發(fā)現(xiàn)全肺組織中，雌性小鼠的Mas受體表達高于雄性小鼠(C)。在僅顯示最小條帶的Mas-/-小鼠肺中證實了Mas受體抗體的特異性 (5)，歸因于Mas和Mas樣家族的許多其他受體之間的序列相似性，由于輕微的交叉反應性而產生背景痕跡。免疫印跡和RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)ALI降低了雄性和雌性小鼠肺中Mas的表達，然而雌性Mas表達仍然是雄性的約5倍(C,D)。這些發(fā)現(xiàn)表明，較高的Mas表達可能有助于提高女性肺屏障功能，而Mas的丟失可能在肺血管泄漏中發(fā)揮重要作用，而與性別無關。相對應的，E2增加了培養(yǎng)的HPMECs中Mas受體mRNA(E)和蛋白(F)水平的表達，
提示E2刺激信號通過ACE2/Ang-(1-7)/Mas軸增加Mas受體的表達，而不是增加其配體的形成。
6、卵巢切除(OVX)小鼠對ALI的影響
為了驗證E2在女性內皮屏障保護中的作用，作者研究了OVX小鼠ALI的影響。與假手術雌性小鼠相比，OVX小鼠在二次打擊ALI模型中發(fā)生了更明顯的肺損傷，表現(xiàn)為濕干肺重量比 (A)、BALF蛋白質濃度(B)和組織學肺損傷評分增加(E)，而HSA比率或MPO活性在OVX小鼠和假手術雌性小鼠之間沒有顯著差異 (C,D)。重要的是，與假手術小鼠相比，OVX中ALI顯著降低了Mas受體的表達(F)，鞏固了女性和雌激素至少在一定程度上通過上調Mas受體賦予內皮屏障保護的觀點。
