lncRNA與免疫抑制微環(huán)境的研究思路

   導(dǎo)語：腫瘤微環(huán)境（TME）是腫瘤細胞賴以生存和發(fā)展的復(fù)雜環(huán)境，主要由細胞成分和非細胞成分組成，共同構(gòu)成了復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境。免疫抑制微環(huán)境是腫瘤微環(huán)境中起抑制免疫功能的部分，其組成包括免疫抑制性細胞和抑制性細胞因子。長鏈非編碼RNA（lncRNA）已被報道參與腫瘤進展，lncRNA與免疫抑制微環(huán)境研究思路值得關(guān)注。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1. LINC00301在非小細胞肺癌（NSCLC）中高表達，提示預(yù)后不良

   通過匯編癌細胞系百科全書(CCLE)以及細胞系、組織檢測發(fā)現(xiàn)LINC00301在NSCLC細胞系中上調(diào)表達。評價LINC00301的臨床意義，發(fā)現(xiàn)LINC00301與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和腫瘤大小密切相關(guān)，高LINC00301水平與較差的總體生存期相關(guān)，LINC00301高表達與較差的預(yù)后相關(guān)。

2. LINC00301在體外加速細胞生長和遷移/侵襲，抑制細胞周期阻滯/細胞凋亡

   探索LINC00301在NSCLC細胞生長中的作用。在4種NSCLC細胞中敲低或過表達LINC00301，進行克隆形成試驗、CCK8、臺盼藍染色和BrdU染色。結(jié)果表明，LINC00301可顯著加速NSCLC細胞生長、細胞遷移和侵襲。沉默LINC00301有利于細胞周期停滯和凋亡。

3. LINC00301在體內(nèi)促進腫瘤生長并促進Treg細胞浸潤

   用A549和SPC-A-1細胞建立了BALB/c裸鼠異種移植模型，LINC00301 敲低鼠的腫瘤體積和重量顯著受到抑制，LINC00301顯著加速了人NSCLC細胞在小鼠模型中的致瘤能力。腫瘤免疫環(huán)境廣泛參與包括NSCLC在內(nèi)的不同癌癥類型的腫瘤生長和發(fā)展。檢測過表達和敲低LINC00301細胞對C57BL/6J小鼠分離的腫瘤中免疫細胞浸潤的作用，分離腫瘤，消化成單細胞后應(yīng)用22種抗體進行CyTOF分析，發(fā)現(xiàn)LINC00301 過表達組表現(xiàn)出較高的CD4 + CD25 + Treg細胞浸潤和較低的CD8 + T細胞浸潤，表明LINC00301通過募集Treg細胞在NSCLC中發(fā)揮免疫抑制作用。

 
4. 轉(zhuǎn)錄因子(TF)FOXC1，并不是甲基化和去乙?；{(diào)節(jié)NSCLC中LINC00301表達

  探索LINC00301的調(diào)節(jié)因子，染色質(zhì)甲基化和去乙?；赡艹聊蚣せ罨虮磉_。通過在線軟件MethPrimer和DBCAT分析LINC00301啟動子，未發(fā)現(xiàn)CpG島；細胞沉默DNA(cytosine-5)-甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)DNMT1不會顯著影響LINC00301的表達，表明DNA甲基化不參與NSCLC細胞中LINC00301的上調(diào)。在細胞中阻礙HDAC1后，LINC00301水平未增強，表明去乙?；粎⑴cNSCLC中LINC00301的上調(diào)。沉默組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2不會顯著影響LINC00301的表達，表明組蛋白甲基化不參與NSCLC細胞中LINC00301的上調(diào)。綜上所述，甲基化和去乙?；粎⑴cNSCLC中LINC00301的上調(diào)。

  為進一步確定LINC00301的上游，通過JARSPAR在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測了可能與LINC00301啟動子相互作用的潛在轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)在NSCLC中上調(diào)的FOXC1。沉默F(xiàn)OXC1顯著促進LINC00301下調(diào)。為證實LINC00301是FOXC1的轉(zhuǎn)錄靶標，將LINC00301啟動子的片段序列克隆到pGL3-basic載體中，轉(zhuǎn)染HEK-293 T細胞后測定熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)前兩個熒光素酶活性是-1395到-882 nt和-2000到-1395 n，表明含有調(diào)控元件的兩個片段對LINC00301轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。FOXC1 敲低顯著降低了-1395到-882 nt片段的熒光素酶活性，表明LINC00301啟動子上-1395至-882 nt的區(qū)域負責foxc1誘導(dǎo)的LINC00301活化。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗發(fā)現(xiàn)FOXC1可以直接結(jié)合NSCLC細胞系中LINC00301啟動子上的位點6（-1395到-1388 nt）。以上結(jié)果顯示，在NSCLC中，LINC00301上調(diào)確實是由FOXC1介導(dǎo)的。

5. LINC00301通過PRC2正向控制H3K27三甲基化

   為闡明LINC00301調(diào)控NSCLC細胞的分子機制，首先評估了LINC00301在NSCLC細胞中的亞細胞定位。FISH鑒定LINC00301位于細胞質(zhì)和細胞核中，但細胞核中LINC00301的比例遠高于細胞質(zhì)中的比例。因此，懷疑LINC00301可能通過細胞核和細胞質(zhì)途徑作為癌基因發(fā)揮作用。

組蛋白甲基化與NSCLC進展過程中的轉(zhuǎn)錄組重編程有關(guān)。NSCLC細胞中LINC00301缺陷特異性地降低了H3K27的二甲基化和三甲基化，而不影響H3K9位點的二甲基化和三甲基化水平。這些表明LINC00301在NSCLC中對H3K27甲基化有特異性正調(diào)控。H3K27的二甲基化和三甲基化一般是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)催化的，RIP試驗發(fā)現(xiàn)在A549和SPC-a-1細胞中，LINC00301在與PRC2元件EZH2和SUZ12的相互作用組中顯著富集。使用鏈霉親和素偶聯(lián)微珠進行RNA下拉試驗驗證生物素化的LINC00301在NSCLC細胞中與EZH2結(jié)合。

6. LINC00301和EZH2之間的相互作用

   為確定LINC00301與EZH2蛋白哪個結(jié)構(gòu)域結(jié)合，蛋白結(jié)構(gòu)域圖譜分析顯示LINC00301直接與EZH2的612–727 aa區(qū)域結(jié)合。體外RNA下拉實驗發(fā)現(xiàn)LINC00301的包含83-123 nt基序序列，結(jié)合并受EZH2保護。消除LINC00301的這個序列可消除其與EZH2的相互作用。RNA EMSA發(fā)現(xiàn)從細胞純化的LINC00301與重組EZH2之間形成復(fù)合物。因此得出結(jié)論，LINC00301通過特定區(qū)域直接與EZH2結(jié)合。

7. LINC00301招募EZH2并介導(dǎo)EAF2啟動子H3K27me3抑制EAF2轉(zhuǎn)錄

    H3K27的三甲基化是由EZH2催化的。LINC00301的沉默顯著增加了細胞中EZH2的靶抑制基因EAF2 mRNA和蛋白水平，EZH2沉默顯著增加細胞中EAF2的mRNA和蛋白水平。因此，LINC00301通過直接與EZH2結(jié)合介導(dǎo)NSCLC細胞中EAF2啟動子H3K27me3來抑制EAF2的表達。

8. LINC00301通過調(diào)節(jié)EAF2/VHL/HIF1α通路促進NSCLC細胞生長和遷移/侵襲
   腫瘤抑制因子EAF2在腫瘤中下調(diào)，文獻報道EAF2可結(jié)合并穩(wěn)定pVHL，進而促進HIF1α降解。因此，EAF2可能是EZH2上調(diào)和HIF1α活化之間的關(guān)鍵連接因子。為證明這一假設(shè)，敲低LINC00301，發(fā)現(xiàn)顯著增加EAF2和pVHL蛋白表達，降低HIF1α蛋白表達，過表達有相反效果。隨后檢測LINC00301/EAF2通路在NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲中的作用，LINC00301 敲低和EAF2過表達阻礙細胞增殖、遷移和侵襲。

9. LINC00301通過海綿miR-1276激活HIF1α發(fā)揮致癌作用

   鑒于LINC00301位于細胞核（初級）和細胞質(zhì)（次級），推測LINC00301也可能通過細胞質(zhì)途徑發(fā)揮其致癌作用。LncRNA可能作為ceRNA調(diào)控miRNA的生物學效應(yīng)。探索與LINC00301相關(guān)的特異性miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-1276是與LINC00301結(jié)合的最富集的miRNA。雙熒光素酶報告基因檢測進一步確定LINC00301與miR-1276的結(jié)合。數(shù)據(jù)庫miRanda和PicTar篩選miR-1276的潛在靶標-癌基因HIF1α，雙熒光素酶受體試驗以驗證miR-1276調(diào)控HIF1α。在NSCLC樣本中，HIF1A mRNA水平與miR-1276表達無顯著相關(guān)性，miR-1276不影響HIF1A mRNA表達水平，但抑制HIF1A蛋白表達水平。這表明miR-1276在轉(zhuǎn)錄后水平影響HIF1α蛋白表達。

研究LINC00301/miR-1276/HIF1α軸在NSCLC細胞增殖和遷移/侵襲中的功能。臺盼藍染色、克隆形成、遷移/侵襲實驗證明miR-1276模擬物抑制生長/遷移/侵襲，HIF1A 過表達促進細胞的生長。當用miR-1276模擬物加HIF1A 過表達處理細胞時，miR-1276逆轉(zhuǎn)了HIF1A在細胞增殖/遷移和侵襲中的作用，HIF1A 過表達逆轉(zhuǎn)了miR-1276的生長抑制功能。這些結(jié)果證明miR1276通過直接靶向HIF1A mRNA的3’-UTR來調(diào)控細胞遷移/侵襲。因此，LINC00301的致癌效率部分歸因于海綿miR-1276，然后觸發(fā)NSCLC中的HIF1α。

總結(jié)：1. LINC00301在NSCLC中高表達，促進腫瘤生長，促進腫瘤微環(huán)境中Treg浸潤，抑制CD8 + T細胞浸潤；

    2. 轉(zhuǎn)錄因子FOXC1調(diào)節(jié)LINC00301在NSCLC中的表達；

    3. LINC00301通過與EZH2直接結(jié)合，介導(dǎo)細胞核中EAF2的表觀遺傳沉默，介導(dǎo)HIF1α的活化，部分介導(dǎo)致癌作用；

    4. LINC00301通過作為miR-1276的ceRNA增加NSCLC細胞質(zhì)中HIF1α的表達，介導(dǎo)致癌作用。