mTOR介導(dǎo)的癌癥耐藥抑制自噬并產(chǎn)生可給藥的代謝脆弱性

近日Philipps-University 的Michael Wanzel和Thorsten Stiewe等人將mTOR誘導(dǎo)的腫瘤耐藥與自噬缺陷的代謝障礙聯(lián)系起來，并為治療難治性腫瘤患者打開了治療窗口。相關(guān)論文于2020年9月份發(fā)表在《nature communications》雜志上。

技術(shù)路線：

一、順鉑耐藥的肺癌代謝脆弱性

我們使用krasq61h突變、p53野生型非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的H460細(xì)胞，將親代H460 (H460par)細(xì)胞通過劑量遞增至NSCLC一線化療標(biāo)準(zhǔn)成分CDDP，獲得耐CDDP的H460res細(xì)胞。當(dāng)檢測耐藥模式時(shí)，H460res細(xì)胞不僅對(duì)CDDP耐藥，而且對(duì)許多其他破壞DNA的化療藥物也耐藥，包括其他鉑化合物、etoposide和doxorubicin(圖1a)。

相比之下，代謝抑制劑2DG和DCA通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重抑制了H460res細(xì)胞的增殖，盡管這兩種化合物對(duì)親代細(xì)胞的影響不顯著(圖1a d)。

2DG和DCA目標(biāo)葡萄糖代謝:2 dg競爭性抑制己糖激酶減緩葡萄糖吸收,而DCA目標(biāo)抑制丙酮酸脫氫酶激酶,從而減少乳酸生產(chǎn)從糖酵解和促進(jìn)線粒體丙酮酸的氧化代謝。對(duì)來自EGFRL858R、T790M和TP53R273H突變型NSCLC的H1975細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以提高CDDP的劑量(圖1e)。

與親代H1975細(xì)胞相比，使用2DG或DCA處理時(shí)，CDDP耐藥H1975細(xì)胞的克隆生長明顯減弱，凋亡增加(圖1f, g)。

為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)是否適用于CDDP治療后體內(nèi)復(fù)發(fā)的腫瘤細(xì)胞，我們使用了有條件的KrasLSL-G12D/+;Trp53flox/flox小鼠。吸入后Cre腺病毒,這些老鼠發(fā)展成肺腺癌(KrasG12D / +; Trp53Δ/Δ)，最初對(duì)CDDP治療但最終復(fù)發(fā)(圖1h).從復(fù)發(fā)小鼠中獲得原發(fā)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，與CDDP幼稚小鼠的腫瘤細(xì)胞相比，對(duì)CDDP的抗性顯著增強(qiáng)，但對(duì)2DG和DCA過敏(圖1h, i)。

總之，在具有不同驅(qū)動(dòng)癌基因和p53共突變的多種不同肺腺癌模型中，CDDP耐藥的發(fā)生明顯易受糖代謝紊亂的影響。

二、代謝脆弱性是由mTOR介導(dǎo)的

與此同時(shí)，耐CDDP的H460、H1975和小鼠腺癌細(xì)胞均顯示mTOR信號(hào)通路明顯升高，表現(xiàn)為mTORC1靶點(diǎn)磷酸化(p70S6KT389、4E-BP1T37/46和ULK1S757)和FancD2表達(dá)升高(圖2a c)。

此外，ATP競爭性mTOR激酶抑制劑AZD805537和 mTORC1選擇性抑制劑雷帕霉素和伊維莫司阻斷了mTOR靶點(diǎn)的磷酸化，有效地使H460res細(xì)胞對(duì)CDDP重新敏感(圖2a, d，補(bǔ)充圖1)。

藥物或rnai介導(dǎo)的mTORC1抑制使cddp耐藥腫瘤細(xì)胞的藥物應(yīng)答模式恢復(fù)到親代細(xì)胞的應(yīng)答模式(圖2d)。

mTOR抑制不僅恢復(fù)了H460res細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性，同時(shí)減弱了2DG/DCA的凋亡反應(yīng)，挽救了在2DG/DCA存在下的克隆生長(圖2d, e，補(bǔ)充圖1和2)。

sirna介導(dǎo)的mTOR敲低以及mTORC1亞基Raptor敲低可以保護(hù)H460res細(xì)胞免受2DG和DCA的侵襲，而敲低mtorc2特異性亞基Rictor則沒有影響(圖2 f, g）。

綜上所述，CDDP耐藥腫瘤細(xì)胞中mTORC1信號(hào)通路的升高不僅是CDDP耐藥表型所必需的，同時(shí)也是其代謝脆弱性的重要因素。

當(dāng)內(nèi)源性mTORC1激酶活性通過激活mtor GTPase Rheb1(腦內(nèi)豐富的Ras同源物)的強(qiáng)化表達(dá)而提高時(shí)，H460par細(xì)胞對(duì)2DG/DCA變得敏感(圖2 h, i)。

當(dāng)rheb1 -抑制型TSC亞基被消耗后，TSC1和TSC2 mTORC1信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，從磷酸化p70S6KT389、4EBP1T37/46和ULK1S757的水平可以明顯看出，這導(dǎo)致了對(duì)2DG和DCA的更高敏感性(圖2h, i)。

此外，在2DG/DCA存在的情況下，不同的mTOR突變體(之前在癌癥患者12中發(fā)現(xiàn)，它們在H460par細(xì)胞中誘導(dǎo)了強(qiáng)mTORC1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))對(duì)2DG/DCA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，并導(dǎo)致克隆細(xì)胞生長受損(圖2j l)。

因此，mTORC1信號(hào)的激活不僅是必需的，而且足以引起2DG和DCA的代謝脆弱性。

三、在CDDP耐藥腫瘤細(xì)胞中mTOR介導(dǎo)的自噬缺陷

測量了氯喹阻斷自噬溶酶體降解后LC3的積累(圖3a)。與H460par細(xì)胞相比，H460res細(xì)胞中LC3的積累明顯減少，表明在沒有2DG/DCA的情況下，自噬通量明顯降低。AZD8055抑制mTOR可以恢復(fù)H460res中LC3的積累，但在H460par細(xì)胞中沒有明顯的作用，說明H460res細(xì)胞基礎(chǔ)自噬通量的降低是mTOR依賴性的。在2DG/DCA處理后，H460par細(xì)胞中LC3水平呈劑量依賴性下降，提示誘導(dǎo)自噬(圖3b, c)。

與H460res細(xì)胞對(duì)2DG/ DCA處理后自噬反應(yīng)的缺陷一致，只有H460par細(xì)胞在處理后出現(xiàn)大量的紅色熒光LC3斑點(diǎn)(圖3d, e)。

四、mTOR對(duì)2DG/DCA敏感，抑制自噬

各種藥物自噬抑制劑作用于自噬過程的不同步驟，使H460par細(xì)胞對(duì)2DG/DCA敏感(圖4a)，支持了自噬在代謝紊亂背景下的保護(hù)作用。同樣，必要自噬基因ATG7的下調(diào)使H460par細(xì)胞對(duì)2DG/ DCA敏感(圖4b, c)。

由于藥物抑制劑和siRNAs可能會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)和不完全抑制，我們還生成了多種由crispr誘導(dǎo)的ATG7插入/缺失突變的H460par細(xì)胞克隆(圖4d f)。

只有完全敲除ATG7的克隆細(xì)胞顯示自噬貨物蛋白p62/SQSTM1的積累和LC3-I向LC3-II處理的失敗，作為自噬缺陷的證實(shí)(圖4d)。

在2DG/DCA處理下，這些克隆也顯示了克隆細(xì)胞的生長和增殖受損(圖4e, f)。

綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)明確地將自噬缺陷與2DG/DCA的抗腫瘤活性聯(lián)系起來，并強(qiáng)調(diào)自噬缺陷是代謝藥物易損的充分原因。在CDDP劑量增加的情況下，我們擴(kuò)大了ATG-7修飾的H460par克隆，產(chǎn)生了具有不同ATG-7突變狀態(tài)的耐CDDP的H460res克隆。

除ATG-7狀態(tài)外，所有CDDP耐藥克隆均對(duì)2DG/DCA過敏，但只有使用ATG-7的克隆通過mTOR抑制從2DG/DCA細(xì)胞毒性中拯救出來(圖4g, h)。

五、mTOR介導(dǎo)的代謝脆弱性延伸到雙胍類化合物

與2DG/DCA相似，H460par細(xì)胞通過誘導(dǎo)自噬通量對(duì)Met/Phen反應(yīng)，在氯喹存在時(shí)LC3的劑量依賴性降解和積累證明了這一點(diǎn)(圖5a)。

相比之下,H460res細(xì)胞證明只有微不足道的LC3的波動(dòng)水平符合遇到的失敗/苯酚的誘導(dǎo)自噬(圖5)。

對(duì)Met/Phen處理的差異反應(yīng)也與mTORC1有關(guān)。mTOR抑制恢復(fù)了Met/ pheno處理的H460res細(xì)胞中LC3的降解(圖5a)，顯示了有效的自噬誘導(dǎo)，并挽救了這些細(xì)胞免于能量應(yīng)激和凋亡(圖5b)

相反，H460res細(xì)胞顯示AMPKT172和ACCS79磷酸化和PARP裂解的增加，分別作為能量應(yīng)激和隨后發(fā)生的細(xì)胞凋亡的信號(hào)(圖5b，左圖)，以及Met/Phen抑制克隆生長的信號(hào)(圖5d)。

由于Rheb1表達(dá)和TSC缺失，mTORC1信號(hào)強(qiáng)烈地降低了Met/Phen處理的H460par細(xì)胞的克隆生長(圖5c, d)。因此，提高mTORC1信號(hào)是滿足Met/Phen敏感性的必要條件。

六、代謝脆弱性與靶向耐藥性相關(guān)

我們生成T47D乳腺癌細(xì)胞的alpelisib和pictilisib耐藥亞克隆，顯示交叉耐藥(圖6a)。

p70S6KT389、4E-BP1T37/46和ULK1S757磷酸化水平的降低證明了兩種藥物都抑制了親代細(xì)胞中的mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)(圖6b)。

與之前的報(bào)道一致，PI3Ki耐藥細(xì)胞在PI3K抑制下維持mTORC1信號(hào)通路，這是耐藥的根本原因(圖6b)。

mTORC1信號(hào)通路抑制了自噬，抗pi3ki的T47D克隆在2DG/DCA處理后未能誘導(dǎo)自噬通量(圖6c)。

值得注意的是，抑制PI3K也刺激了LC3處理和p62降解，表明自噬誘導(dǎo)再次只在親本亞克隆，而不耐PI3Kiresistant亞克隆(圖6b)。
   mTOR抑制后，2DG/DCA恢復(fù)了自噬誘導(dǎo)，表明耐PI3Kiresistant腫瘤細(xì)胞自噬反應(yīng)存在嚴(yán)重的mTOR依賴性缺陷。與我們之前的結(jié)果一致，這轉(zhuǎn)化為通過2DG/DCA治療，mTOR依賴大量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和降低克隆生長(圖6d, e)，這將我們對(duì)mTOR誘導(dǎo)代謝脆弱性的研究從傳統(tǒng)化療擴(kuò)展到靶向治療耐藥性。

七、代謝抑制劑在體內(nèi)靶向CDDP耐藥的癌細(xì)胞

治療期間定期采集的血液樣本的熒光素酶活性測量提供了治療期間腫瘤負(fù)荷的細(xì)胞類型特異性縱向監(jiān)測(圖7a).

DCA選擇性地抑制H460res細(xì)胞的生長，導(dǎo)致終末期腫瘤中H460res細(xì)胞減少40倍。為了證實(shí)觀察到的細(xì)胞豐度變化，我們分析了終末期小鼠的腫瘤裂解液中mTOR和自噬標(biāo)記物(圖7b)。

與由兩種腫瘤細(xì)胞類型組成的未治療小鼠的腫瘤相比，cddp治療組的腫瘤表現(xiàn)出mTOR信號(hào)上調(diào)、LC3處理缺陷和p62降解(圖7b，左)，這與基于熒光腫瘤監(jiān)測觀察到的cddp誘導(dǎo)的H460res細(xì)胞富集相一致。相比之下,DCA處理的小鼠腫瘤顯示減少的mTOR信號(hào)和減少的LC3水平和p62(圖7 b,右面板),符合DCA H460res細(xì)胞耗竭。

在H460par腫瘤中，mTOR信號(hào)在治療期間保持較低或下降，而在H460res腫瘤中，mTOR信號(hào)維持甚至上升(圖7c)。

最重要的是，在H460res腫瘤中，作為細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的cleaved - caspase-3在單次2DG或DCA處理后顯著上調(diào)(圖7c, d，補(bǔ)充圖6)。

單獨(dú)使用Phen時(shí)，雖然2DG/DCA的劑量降低到50%，但僅輕微增加了細(xì)胞凋亡，但卻大大增強(qiáng)了2DG/DCA的凋亡作用(圖7d)。