單細(xì)胞測(cè)序與TCGA數(shù)據(jù)助力膀胱癌發(fā)表高分文章

膀胱癌是世界上最普遍的泌尿生殖系統(tǒng)惡性疾病之一，每年診斷出約430,000例新病例，造成165,000多例死亡。盡管在癌癥生物學(xué)和治療方面已取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但膀胱癌患者的臨床結(jié)果仍不令人滿意。在過(guò)去的十年中，與藥物發(fā)現(xiàn)的治療靶標(biāo)有關(guān)的腫瘤微環(huán)境（TME）一直是癌癥生物學(xué)研究的熱門(mén)領(lǐng)域。值得注意的是，膀胱癌是免疫力最低的浸潤(rùn)癌之一，這可能是對(duì)抗PD1治療反應(yīng)差的原因，為膀胱癌設(shè)計(jì)新的治療策略一直是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。之前，已經(jīng)報(bào)道了膀胱癌的分子亞型顯示出不同的細(xì)胞類型特異性表達(dá)模式，這表明膀胱癌的異質(zhì)性至少部分是由微環(huán)境內(nèi)部的不同細(xì)胞類型組成的。但是，直到最近，相關(guān)的研究還很少。近期，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿科陳科教授及其團(tuán)隊(duì)分析了膀胱尿路上皮癌或癌旁粘膜樣品中單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，并繪制了膀胱癌組織內(nèi)整個(gè)TME的圖集，促進(jìn)了對(duì)膀胱癌患者之間異質(zhì)性的理解，并為膀胱尿路上皮癌的個(gè)體化治療提供了基礎(chǔ)。相關(guān)研究以“Single-cell RNA sequencing highlights the role of in?ammatory cancer-associated ?broblasts in bladder urothelial carcinoma”為題發(fā)表在Nature communications雜志上，雜志影響因子12.121。 

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1、膀胱癌細(xì)胞異質(zhì)性

作者通過(guò)質(zhì)量控制消除了批次之間的批次效應(yīng)，將52721個(gè)單細(xì)胞聚集為八個(gè)主要簇，簇特異性基因被用來(lái)標(biāo)記來(lái)注釋細(xì)胞類型：上皮（EPCAM+）細(xì)胞；內(nèi)皮（CD31+）細(xì)胞；兩種類型的成纖維細(xì)胞（COL1A1+）-iCAF（PDGFRA+）和肌CAF（mCAFs）（RGS5+）；B細(xì)胞（CD79A+）；骨髓細(xì)胞（LYZ+）；T細(xì)胞（CD3D+）；和肥大細(xì)胞（TPSAB1+）（a,b）。隨后，將EPCAM +上皮細(xì)胞（EPC）重新聚集以產(chǎn)生17個(gè)簇，通過(guò)InferCNV證實(shí)了癌細(xì)胞顯示出患者特異性的表達(dá)模式可能是由拷貝數(shù)變異（CNV）引起的極高的異質(zhì)性的假設(shè)，且發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的一些細(xì)胞幾乎不具有CNV，表現(xiàn)出與正常EPC相似的表達(dá)模式，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一系列基因在對(duì)照組和CNV未檢出組中特別表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞中幾乎不存在（c,d）?；虮倔w富集分析表明，這些基因富集于免疫相關(guān)途徑，特別是B細(xì)胞相關(guān)途徑（e）。與正常上皮細(xì)胞相比，癌細(xì)胞幾乎喪失了產(chǎn)生免疫球蛋白的能力，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)它們表達(dá)的MHC-II分子水平較低（f,g），表明膀胱癌細(xì)胞可能下調(diào)免疫原性以逃避免疫檢測(cè)。通過(guò)基因組變異分析（GSVA）進(jìn)行的途徑分析顯示，CNV高水平人群中E2F靶標(biāo)、MYC靶標(biāo)和G2M檢查點(diǎn)途徑富集，而炎癥和其他免疫相關(guān)途徑則被下調(diào)（h），進(jìn)一步證實(shí)了處于膀胱癌晚期的癌細(xì)胞下調(diào)了免疫原性并顯示出高增殖能力。

2、腫瘤區(qū)域的單核細(xì)胞經(jīng)歷M2極化

作者共鑒定出7種細(xì)胞類型：腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞、CD1C+樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、增殖性骨髓細(xì)胞、交叉呈現(xiàn)DC、卵泡B細(xì)胞和LAMP3+DC。兩個(gè)細(xì)胞簇均表達(dá)髓樣標(biāo)志物以及上皮或內(nèi)皮標(biāo)志物被認(rèn)為是雙峰（a）。單核細(xì)胞大部分起源于正常的粘膜組織，而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞則富集在膀胱癌組織中。此外，這兩種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組表現(xiàn)出連續(xù)的變化，表明募集到腫瘤區(qū)域的單核細(xì)胞被重新編程為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（b）。作者發(fā)現(xiàn)BACH1，MAFG和NFE2這三個(gè)基序的活性被下調(diào)，而MAF，STAT1和STAT2基序的激活導(dǎo)致M2極化過(guò)程，為抑制或逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境的形成提供了潛在的目標(biāo)（c,d）。此外，在這種分化過(guò)程中，共抑制因子CD274，LGALS9，CD276，TIGIT和PDCD1LG2均被上調(diào)，而共激活因子被下調(diào)（e）。三個(gè)DC亞組中，LAMP3+ DC組表達(dá)了各種編碼細(xì)胞因子的基因，包括CCL17，CCL19和CCL22（f），這些細(xì)胞因子幾乎完全來(lái)源于膀胱癌的LAMP3+ DC（g）。LAMP3+ DCs顯示出最高水平的CD274（f），甚至高于從膀胱癌組織的Tregs中觀察到的水平，表明該DC亞組可以直接抑制CD8+ T細(xì)胞或通過(guò)募集Tregs進(jìn)入腫瘤區(qū)域。在TCGA膀胱尿路上皮癌隊(duì)列中，LAMP3+ DC簽名與均為CCR4+的Treg簽名和Th2簽名高度正相關(guān)，但與CTL簽名沒(méi)有高度相關(guān)（h）。

3、膀胱癌成纖維細(xì)胞亞型

成纖維細(xì)胞（COL1A1+）分為兩種不同類型：PDGFRA+成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出各種細(xì)胞因子和趨化因子的強(qiáng)表達(dá)，包括CXCL12，IL6，CXCL14，CXCL1和CXCL2；RGS5+成纖維細(xì)胞具有與肌癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞（mCAFs）相似的特征（a,b）。通過(guò)免疫熒光法評(píng)估了腫瘤和非惡性膀胱基質(zhì)組織中現(xiàn)有的iCAF和mCAF發(fā)現(xiàn)在，不同類型的癌癥中CAFs具有類似的亞群（c）。為了調(diào)查每個(gè)亞組的功能，作者對(duì)iCAF和mCAF的差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO富集分析發(fā)現(xiàn)iCAF與細(xì)胞外基質(zhì)的組織，細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)和血管生成有關(guān)，而肌肉系統(tǒng)過(guò)程，粘著斑和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的途徑則明顯富含mCAF（d）。GSEA同樣顯示iCAF與細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)，表明其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的潛在作用。細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用途徑也豐富了iCAFs。相反，肌肉收縮和PGC1A途徑富含mCAF（e,f）。由于細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用在iCAF中富集，因此研究了膀胱癌TME中細(xì)胞因子的表達(dá)水平。CXCL12與TCGA膀胱尿路上皮癌隊(duì)列中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞簽名呈正相關(guān)，而較高水平的CXCL12與不良預(yù)后顯著相關(guān)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CXCL12在膀胱癌組織中通過(guò)iCAFs表達(dá)（g-h）。

4、iCAF的增殖作用

通過(guò)SCENIC分析確定了兩個(gè)CAF亞組中的必需基序，TCF21和TWIST2基序在iCAF中被高度激活（a,b）。隨后，通過(guò)GO富集預(yù)測(cè)iCAF具有生長(zhǎng)因子活性，并分析了膀胱癌TME中VEGF，F(xiàn)GF和IGF家族的表達(dá)水平（c），在這些生長(zhǎng)因子中，IGF1是iCAF特異性的組因子，與總體生存期較差有關(guān)（d,e）。為了驗(yàn)證其促增殖作用，作者通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)iCAF進(jìn)行了分類，并將它們與膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系進(jìn)行了共培養(yǎng)，顯示出更高的增殖能力，這證實(shí)了iCAF在膀胱癌中的腫瘤作用（f,g）。

5、scRNA-seq與公共數(shù)據(jù)集相關(guān)分析

為了研究本研究中確定的細(xì)胞類型的臨床作用，作者使用CIBERSORTx 評(píng)估TCGA膀胱尿路上皮癌隊(duì)列樣本中每種細(xì)胞類型的比例，發(fā)現(xiàn)只有iCAF和mCAF的積累與較差的總體生存率相關(guān)（a,b）。當(dāng)將細(xì)胞分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)與臨床信息相關(guān)聯(lián)時(shí)發(fā)現(xiàn)先前描述的分子亞型之間的細(xì)胞類型豐度變化很大，腫瘤純度最高的乳頭狀乳頭狀瘤的預(yù)后最好，而其他四組的總生存率則無(wú)明顯差異，其中基底鱗癌顯示出最低的腫瘤純度，還富集了T細(xì)胞，表明抗免疫檢查點(diǎn)療法可能適合這些患者（c,d）。隨后，作者擴(kuò)大了臨床隊(duì)列，從GEO和ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了3000多個(gè)微陣列分析的膀胱癌和非惡性粘膜樣品，通過(guò)Combat功能消除了可能的批量效應(yīng)，然后使用ConsensusClusterPlus將2959個(gè)腫瘤樣品分為五個(gè)主要簇，四個(gè)主要的團(tuán)簇顯示了與熒光團(tuán)簇相似的特征:乳頭狀團(tuán)簇、管狀團(tuán)簇、熒光浸潤(rùn)團(tuán)簇和基底鱗狀團(tuán)簇。另一簇與TCGA 膀胱尿路上皮癌中的神經(jīng)組不同，同時(shí)具有光鱗狀和管腔特征，故命名為管腔躍遷。該薈萃隊(duì)列中的總生存率與TCGA高度對(duì)應(yīng)，證明了CAF在膀胱癌進(jìn)程中的重要作用（e-f）。

6、構(gòu)建基于iCAF的監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)

作者通過(guò)CellphoneDB2研究了細(xì)胞類型之間的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)，iCAFs與其他細(xì)胞類型的相互作用最多，并且與ECs的相互作用特別強(qiáng)（a）。iCAFs中CXCL12表達(dá)水平較高，其受體包括DPP4、CXCR3、CXCR4和ACKR3 (CXCR7)。由于CXCR4和CXCR3在免疫細(xì)胞上廣泛表達(dá)，iCAFs分泌CXCL12負(fù)責(zé)膀胱癌的免疫浸潤(rùn)狀態(tài)。iCAFs分泌的CCL2和CXCL1可與ECs表面高表達(dá)的ACKR1相互作用。這些細(xì)胞因子之前被報(bào)道與膀胱癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，確定它們的起源為iCAFs（b,d）。作者認(rèn)為，iCAFs可產(chǎn)生VEGF，包括VEGFA和VEGFB，它們與內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體（FLT1、KDR、MET和FLT4）結(jié)合，促進(jìn)血管生成。此外，F(xiàn)GFR1在iCAFs和ECs上表達(dá)，而FGFR3在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。這些受體可與FGF結(jié)合，包括來(lái)自iCAFs的FGF2和FGF7，并表現(xiàn)出促增殖作用。IGF1R是IGF1的受體，在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)，提示iCAF也可介導(dǎo)對(duì)順鉑的耐藥。值得注意的是，腫瘤細(xì)胞中VEGFA表達(dá)水平較高，其促血管生成能力最強(qiáng)。此外，高級(jí)別腫瘤細(xì)胞在iCAFs上高表達(dá)IGF2，并與IGF2R相互作用，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展（c, e）。綜上所述， iCAFs可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的增殖。

結(jié)論：

1、作者在膀胱癌微環(huán)境中鑒定出19種不同的細(xì)胞類型，表明腫瘤內(nèi)異質(zhì)性很高。

2、研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞下調(diào)了MHC-II分子，提示癌細(xì)胞的下調(diào)免疫原性可能有助于形成免疫抑制性微環(huán)境，且發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞在腫瘤區(qū)域經(jīng)歷M2極化并分化。

3、LAMP3+ DC亞組可能能夠募集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，可能參與免疫抑制性TME的形成。

4、炎癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞與腫瘤不良的預(yù)后顯著相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

Chen, ZH; Zhou, LJ; Liu, LL，et al. Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma. Nature communications. 2020.