國(guó)自然熱點(diǎn)之焦亡

細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）是一種炎癥細(xì)胞程序性死亡方式，主要通過(guò)炎癥小體介導(dǎo)包含半胱天冬酶-1（Caspase-1）在內(nèi)的多種Caspase的激活，造成包括GSDMD在內(nèi)的多種Gasdermin家族成員發(fā)生剪切和多聚化，造成細(xì)胞穿孔，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。近些年細(xì)胞焦亡的中標(biāo)數(shù)一直在上升，特別是2018和2019，這兩年是呈現(xiàn)直線上升。接下來(lái)，我們通過(guò)一篇文獻(xiàn)來(lái)了解焦亡研究的套路。

這篇題為“Neural progenitor cell pyroptosis contributes to Zika virus-induced brain atrophy and represents a therapeutic target”的文章講述了ZIKV破壞神經(jīng)發(fā)生并導(dǎo)致小頭畸形的機(jī)制。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ZIKV通過(guò)誘導(dǎo)caspase-1和 GSDMD介導(dǎo)的焦亡直接影響神經(jīng)祖細(xì)胞的發(fā)育，將ZIKV感染與小頭畸形的發(fā)生聯(lián)系起來(lái)。重要的是，caspase- 1缺失或其抑制劑VX-765治療可減少ZIKV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和焦亡，顯著減輕體內(nèi)神經(jīng)病理學(xué)和腦萎縮。

結(jié)果：

1）  ZIKV在新生鼠腦中復(fù)制并導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)病理學(xué)改變和腦萎縮

為了評(píng)估ZIKV感染在小鼠腦發(fā)育過(guò)程中是否具有致病性，WT幼鼠皮下感染5×105個(gè)ZIKV PFU。值得注意的是，在從感染后3dpi到21 dpi期間，ZIKV感染的小鼠顯示出比模擬感染的小鼠更低的體重(圖1A)。此外，在ZIKV感染的小鼠中有明顯的腦萎縮，表現(xiàn)為在21 dpi時(shí)背側(cè)腦面積減少(圖1 B和1C)。使用qRT-PCR，證實(shí)在ZIKV感染小鼠的大腦中存在大量病毒核糖核酸拷貝，表明觀察到的腦萎縮與ZIKV感染密切相關(guān)(圖1D)。為了進(jìn)一步研究ZIKV感染對(duì)腦發(fā)育的可能致病作用，對(duì)小鼠腦的組織切片進(jìn)行了神經(jīng)病理學(xué)檢查。值得注意的是，ZIKV感染的小鼠大腦顯示出大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死和主要在海馬、丘腦和皮層區(qū)域的正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，表明大腦中存在嚴(yán)重的局灶性炎癥，而模擬感染不會(huì)引起病理變化(圖1 E和F)。此外，ZIKV感染小鼠的大腦經(jīng)常出現(xiàn)單核細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的血管周圍套袖。綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)表明ZIKV感染導(dǎo)致腦萎縮，并在所用的小鼠感染模型中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎性腦損傷。

2）  ZIKV感染導(dǎo)致體內(nèi)NPC焦亡

基于我們前述對(duì)寨卡病毒感染小鼠大腦炎癥損傷的觀察，我們進(jìn)一步探索ZIKV感染是否也能在NPC人群的大腦中引發(fā)caspase-1介導(dǎo)的焦亡。如圖2 A和圖2B所示，當(dāng)在具有指示標(biāo)記的NPC小生境中對(duì)裂解的caspase-1 (p10)和PI進(jìn)行染色時(shí)，感染寨卡病毒的小鼠顯示出豐富的裂解的caspase-1和PI+細(xì)胞。

由于焦亡與炎癥小體激活有聯(lián)系，接下來(lái)在從ZIKV感染和模擬感染小鼠獲得的腦組織標(biāo)本中評(píng)估了更廣泛的炎癥小體基因。如圖2C所示，在小鼠腦組織標(biāo)本中可檢測(cè)到所有與炎癥體相關(guān)的基因，與模擬感染相比，寨卡病毒感染的小鼠中IL1B、IL-18、CASP1、ASC和GSDMD轉(zhuǎn)錄物的水平顯著升高。此外，與模擬對(duì)照相比，NLRP3在ZIKV感染的腦中的表達(dá)顯著增加 (圖2D)。在ZIKV感染的大腦中，caspase-1和GSDMD的裂解程度都很高(圖2E)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)支持了ZIKV感染NPCs并在體內(nèi)引發(fā)焦亡的觀點(diǎn)。

3）  ZIKV在體外感染人NPCs并誘導(dǎo)焦亡

為了進(jìn)一步了解ZIKV和神經(jīng)發(fā)生障礙之間的可能聯(lián)系，我們接下來(lái)評(píng)估了ZIKV誘導(dǎo)的人NPCs(hNPCs)的焦亡的生物學(xué)效應(yīng)。在ZIKV感染的hNPCs中，出現(xiàn)典型的炎性改變，包括細(xì)胞腫脹和膜破裂(圖3A)。hNPCs中的ZIKV感染通過(guò)細(xì)胞中ZIKV E抗原和SOX2的共同存在被證實(shí)(圖3B)。此外，通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行的超微結(jié)構(gòu)分析也揭示了壞死的形態(tài)學(xué)變化，顯示了ZIKV感染后染色質(zhì)聚集、線粒體腫脹和質(zhì)膜破裂(圖3C)。我們接下來(lái)檢查了細(xì)胞裂解物中caspase-1的活性，數(shù)據(jù)顯示受ZIKV感染的細(xì)胞中caspase-1活性增加(圖3D)。此外，用PI/Hoechst 33342雙染色法進(jìn)一步驗(yàn)證了炎癥壞死細(xì)胞，正如所料，感染ZIKV的hNPCs發(fā)生了焦亡(圖3 E和F)。此外，與模擬感染相比，ZIKV感染顯著增加了乳酸脫氫酶的釋放量，而與siRNA陰性對(duì)照組相比，沉默caspase-1的表達(dá)減少了ZIKV感染引起的乳酸脫氫酶的釋放量(圖3G)，這表明caspase-1介導(dǎo)的NPCs的焦亡有助于ZIKV發(fā)病機(jī)制。與模擬感染的對(duì)應(yīng)細(xì)胞相比，ZIKV感染觸發(fā)了hNPCs中caspase-1和GSDMD的裂解(圖3H)。 

4）  ZIKV誘導(dǎo)人類神經(jīng)球的焦亡

為了進(jìn)一步說(shuō)明神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中ZIKV感染的生物學(xué)效應(yīng)，我們接下來(lái)用ZIKV感染神經(jīng)細(xì)胞的3D培養(yǎng)物，然后觀察神經(jīng)球的形成。我們發(fā)現(xiàn)模擬感染的hNPCs產(chǎn)生圓形神經(jīng)球，而ZIKV感染的神經(jīng)球表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)異常，并有焦亡的跡象(圖4 A和4B)。此外，模擬感染的神經(jīng)球隨著時(shí)間的推移繼續(xù)生長(zhǎng)，但只有少數(shù)ZIKV感染的神經(jīng)球以較小的尺寸存活(圖4A-D)。為了進(jìn)一步證實(shí)感染ZIKV的神經(jīng)球發(fā)生了焦亡，我們用活性caspase-1和PI對(duì)神經(jīng)球進(jìn)行了雙重染色。如圖4E所示，感染ZIKV的神經(jīng)球含有染色強(qiáng)烈的活性caspase-1和PI，這表明ZIKV感染可以誘導(dǎo)神經(jīng)球的焦亡。神經(jīng)球感染ZIKV通過(guò)神經(jīng)球中存在ZIKV E抗原和SOX2被證實(shí)(圖4F)，此外，還測(cè)定了ZIKV感染后神經(jīng)球的乳酸脫氫酶釋放，表明ZIKV感染誘導(dǎo)了神經(jīng)球的乳酸脫氫酶釋放(圖4G)。

5）  Caspase-1的缺失逆轉(zhuǎn)ZIKV誘導(dǎo)的神經(jīng)病理學(xué)改變和腦萎縮

我們生成了caspase-1-null小鼠，以進(jìn)一步評(píng)估焦亡ZIKV誘導(dǎo)的腦畸形發(fā)病機(jī)制中的作用。我們發(fā)現(xiàn)與模擬感染組相比，感染ZIKV的WT小鼠體重較低，而ZIKV感染的Casp1?/?小鼠體重與模擬感染組在21日齡時(shí)的體重相似(圖5A)。與ZIKV感染的野生型小鼠相比，ZIKV感染的Casp1?/?小鼠的嚴(yán)重腦萎縮被徹底消除(圖5 B和5C)。組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步表明，與ZIKV感染的野生型小鼠相比，Casp1?/?小鼠都免于炎癥誘導(dǎo)的損傷(圖5D)。此外，當(dāng)在腦組織中測(cè)量促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的表達(dá)水平時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，在感染ZIKV的小鼠中，caspase-1的減少消除了IL-1β和IL-18的增加(圖5 E和F)。此外，我們的結(jié)果還表明，ZIKV感染引發(fā)了GSDMD的裂解，而caspase-1缺失減弱了GSDMD的裂解(圖5G)。因此，由ZIKV引起的神經(jīng)病理學(xué)和腦萎縮可以通過(guò)廢除caspase-1介導(dǎo)的焦亡來(lái)抑制。

6）  VX-765治療減輕ZIKV感染小鼠的神經(jīng)病理學(xué)和腦萎縮

caspase-1在介導(dǎo)ZIKV相關(guān)神經(jīng)病理學(xué)中的重要作用促使我們研究caspase-1是否可以成為神經(jīng)病理學(xué)和小頭畸形的潛在治療靶點(diǎn)。VX-765是是一種強(qiáng)效和選擇性的caspase-1抑制劑。結(jié)果表明，對(duì)照載體或Z-DEVD-FMK處理的小鼠比模擬感染的對(duì)照小鼠增重慢，而VX-765處理的小鼠沒(méi)有出現(xiàn)這種結(jié)果(圖6A)。30天后，ZIKV感染小鼠的存活率僅為38%，相比之下，VX-765治療的小鼠的存活率更高，為69%。盡管用Z-DEDFMK治療的所有小鼠在感染后第16天死亡(圖6B)，但進(jìn)一步的觀察表明，Z-DEVD-FMK治療的小鼠與用載體或VX-765治療的小鼠在沒(méi)有ZIKV感染的情況下在體重變化和存活率方面沒(méi)有顯著差異。此外，與載體對(duì)照處理的ZIKV感染小鼠相比，VX-765處理減輕了由ZIKV感染引起的嚴(yán)重腦萎縮(圖6 C和6D)。

進(jìn)一步的組織病理學(xué)檢查顯示，在ZIKV感染的對(duì)照組和Z-DEVD-FMK治療的小鼠的海馬中觀察到大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死位點(diǎn)，但在VX-765治療后顯著減弱(圖6E)。免疫組織化學(xué)(IHC)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的Iba-1和GFAP特異性標(biāo)記物的分析分別用于評(píng)估大腦中的神經(jīng)炎癥。如圖6F所示，與模擬感染小鼠相比，ZIKV感染對(duì)照組和Z-DEVD-FMK治療組小鼠的海馬體中的Iba-1和GFAP水平顯著更高。值得注意的是，VX-765的治療降低了Iba-1和GFAP的表達(dá)水平，與未感染小鼠的大腦相當(dāng)，這表明VX-765能夠逆轉(zhuǎn)神經(jīng)炎癥。

此外，在暴露于ZIKV的對(duì)照載體處理的小鼠的腦組織中，促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的表達(dá)水平上調(diào)，而這種上調(diào)被VX-765處理抑制，但不被Z-DEVD-FMK抑制(圖6 G和H)。一致地，在VX-765治療后，ZIKV感染小鼠的大腦中caspase-1和GSDMD的蛋白酶裂解受到抑制，這表明VX-765抑制了體內(nèi)與ZIKV感染相關(guān)的焦亡(圖6I)。