細(xì)胞外囊泡測(cè)序和反卷積模型預(yù)測(cè)追蹤黑色素瘤檢查點(diǎn)阻斷
免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）為疾病治療帶來了希望，但是大多數(shù)患者不響應(yīng)ICI。作者鑒定驗(yàn)證來源于細(xì)胞外囊泡（EV）的生物標(biāo)志物，允許無創(chuàng)監(jiān)測(cè)腫瘤內(nèi)在和宿主免疫狀態(tài)，以及預(yù)測(cè)ICI反應(yīng)。最終證實(shí)，EVs作為一種非侵襲性生物標(biāo)志物，聯(lián)合探測(cè)ICI的腫瘤內(nèi)在和免疫改變，作為ICI反應(yīng)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，監(jiān)測(cè)腫瘤的持久性和免疫激活。本文于2020年11月發(fā)表于SCIENCE ADVANCE，影響因子13.116。
技術(shù)路線如下：
主要結(jié)果如下：
1、腫瘤與EV RNA的一致性
為了確定患者血漿來源的EV是否與腫瘤表達(dá)譜相關(guān)，作者分析了9個(gè)患者的配對(duì)EV和腫瘤組織的表達(dá)譜，結(jié)果顯示兩個(gè)表達(dá)譜的相關(guān)性很高，R2為0.82（圖1A）。相關(guān)性分析表明，大多數(shù)存在于腫瘤的基因也存在于EV中（圖1B）。通過GAGE進(jìn)行基因集富集分析，發(fā)現(xiàn)僅在EV中顯著富集免疫相關(guān)特征，如T細(xì)胞激活和NK細(xì)胞激活，而腫瘤特異的轉(zhuǎn)錄本富集于代謝和腫瘤相關(guān)途徑（圖1C）。為了確定EV中所代表的細(xì)胞群，使用CIBERSORT來推斷患者EV中免疫細(xì)胞類型的富集。作者觀察到有5種免疫細(xì)胞亞群特異性存在于EV中（中性粒細(xì)胞，NK細(xì)胞，CD4+/CD8+T細(xì)胞），而EV中巨噬細(xì)胞/肥大細(xì)胞相對(duì)消耗，這些表明EV是被過度富集用于免疫人群對(duì)抗程序性細(xì)胞死亡（PD1）響應(yīng)很重要的信號(hào)?？傊?，這些結(jié)果使得作者猜測(cè)患者治療前和治療中的EV轉(zhuǎn)錄本可用于預(yù)測(cè)或反映ICI抗性。
2在處理后EV表達(dá)譜中，對(duì)有反應(yīng)者和無反應(yīng)者進(jìn)行分層的生物途徑和基因
鑒于腫瘤治療后的特征比預(yù)處理值更能代表ICI響應(yīng)，作者將處理后的EV轉(zhuǎn)錄本和ICI響應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。通過分子特征圖譜使用不同的基因集進(jìn)行基因集變異分析，作者觀察到258個(gè)途徑顯著區(qū)別開響應(yīng)者和非響應(yīng)者，其中有25個(gè)在驗(yàn)證隊(duì)列中顯著，如圖2A，包括T細(xì)胞受體，CTLA4, TGF-beta，SMAD2/3, Notch,腫瘤壞死因子受體2，血管表皮生長(zhǎng)因子受體都涉及了ICI抗性和黑色素瘤進(jìn)展。根據(jù)縱向數(shù)據(jù)，作者通過單樣本GSVA可視化了處理途徑的動(dòng)力學(xué)并觀察到在非響應(yīng)者處理中T細(xì)胞受體途徑激活下降（圖2C）。在基因水平，有1240個(gè)正常的和43個(gè)FDR校正的DEGs在發(fā)現(xiàn)的隊(duì)列中，在驗(yàn)證的隊(duì)列中有514個(gè)正常的和3個(gè)DEGs。80個(gè)DEGs共享了成功的P值驗(yàn)證，47個(gè)DEGs在P值、最小表達(dá)和log fold change水平成功復(fù)制（圖2C）。大量共享的DEG反映出基因集富集，包括KLF10和WNT8B。作者檢測(cè)了睪丸癌抗原（MAGEA1 and MAGEA3），在處理中的這4個(gè)DEGs都表現(xiàn)出時(shí)間動(dòng)態(tài)相對(duì)于在第一次收集的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)變化（圖1D）。
圖2在處理后EV表達(dá)譜中，對(duì)有反應(yīng)者和無反應(yīng)者進(jìn)行分層的生物途徑和基因
3在預(yù)處理的EV表達(dá)譜中，有反應(yīng)者/無反應(yīng)者的分層生物途徑和基因
作者評(píng)估了預(yù)處理的EV轉(zhuǎn)錄本是否是區(qū)分響應(yīng)者和非響應(yīng)者的，通過執(zhí)行基因集富集使用GSVA，顯示101差異表達(dá)的MDigDB途徑在發(fā)現(xiàn)的隊(duì)列，其中26在驗(yàn)證隊(duì)列重復(fù)（圖3A）。與處理中的途徑相比，Notch和TGF-beta途徑在發(fā)現(xiàn)的隊(duì)列中差異，MAPK-ERRB4和角質(zhì)化也觀察到差異。DEGs在內(nèi)的成員包括免疫和腫瘤相關(guān)途徑反映出ICI抗性或腫瘤生長(zhǎng)，如CD1A，MAPK2K4，TRBV7-2，和IGFL1（圖3B）。作者隨后使用最好性能的超級(jí)參數(shù)集去評(píng)估參評(píng)集的性能。通過總計(jì)所有100個(gè)指標(biāo)的結(jié)果，作者構(gòu)建了ROC曲線反映了訓(xùn)練交叉檢測(cè)性能和參評(píng)集性能（圖3C）。為了評(píng)價(jià)二分類精度，使用AUROC，這是一個(gè)二元分類器，可以將隨機(jī)選擇的有反應(yīng)的病人排在隨機(jī)選擇的無反應(yīng)的病人前面。作者觀察到多個(gè)驗(yàn)證的DEGs (IGFL1、TFF2和MAP2K4)在無進(jìn)展或總生存率中顯示顯著分層（圖3D）。
圖3在預(yù)處理的EV表達(dá)譜中，有反應(yīng)者/無反應(yīng)者的分層生物途徑和基因
4、EV表達(dá)譜的反卷積和RNA-seq表達(dá)譜中驅(qū)動(dòng)突變的分析
對(duì)腫瘤來源EV和非腫瘤來源EV的貢獻(xiàn)進(jìn)行分析，可能揭示反應(yīng)相關(guān)的變化是反映了腫瘤微環(huán)境的變化還是非腫瘤的變化。因此，作者建立了一個(gè)概率反卷積模型來進(jìn)行推斷，其模型示意圖如圖4A所示。為了評(píng)估模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，分析了參與EV功能或免疫治療反應(yīng)的已知基因（圖4B），其次是在處理前和處理后的時(shí)間點(diǎn)的DEGs的分析（圖4C）。該模型還探索了跨基因集的富集，并計(jì)算了一個(gè)基因集水平的腫瘤片段，顯示了腫瘤來源轉(zhuǎn)錄本的顯著富集（圖4D）。在評(píng)估ICI和黑素瘤相關(guān)的KEGG途徑，模型結(jié)果與預(yù)期排序一致，例如與黑素瘤相關(guān)的途徑具有更高的腫瘤分?jǐn)?shù)（圖4E）。經(jīng)驗(yàn)證的預(yù)處理的DEGs富集了腫瘤來源的基因，為治療時(shí)的DEGs在非腫瘤方面有更大的貢獻(xiàn)（圖5F）。這些結(jié)果表明處理中的DEGs優(yōu)先反映ICI誘導(dǎo)的改變。
圖4 EV表達(dá)譜的反褶積和RNA-seq表達(dá)譜中驅(qū)動(dòng)突變的分析
5、比較響應(yīng)者和非響應(yīng)者間COSMIC突變驅(qū)動(dòng)的裝載
相對(duì)于總體突變庫的癌癥體細(xì)胞突變目錄（COSMIC）數(shù)據(jù)庫可歸因于體細(xì)胞突變量的變化，而不是種系突變的差異。作者觀察到響應(yīng)者的COSMIC驅(qū)動(dòng)程序體細(xì)胞突變率明顯高于無反應(yīng)者（圖5A和5B）。這也反映在生存分析中，如圖5C，可以觀察到在高COSMIC突變率(隊(duì)列中前50%)的患者與低COSMIC突變率的患者之間顯著分層（圖5C），高突變分?jǐn)?shù)的患者總體存活時(shí)間更長(zhǎng)。這表明EV RNA-seq癌癥驅(qū)動(dòng)信息對(duì)于預(yù)測(cè)ICI治療的長(zhǎng)期療效可能比短期療效更有效。
圖5 比較響應(yīng)者和非響應(yīng)者間COSMIC突變驅(qū)動(dòng)的裝載
總之，EV表達(dá)譜揭示了ICI耐藥性和黑色素瘤進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素，及表現(xiàn)出差異表達(dá)的基因/途徑，并與ICI的臨床反映相關(guān)。非卷積模型估計(jì)了腫瘤和非腫瘤來源的貢獻(xiàn)，從而能夠解釋差異表達(dá)的基因/途徑。EV RNA-seq突變也區(qū)分了ICI反應(yīng)。EV可以作為非侵襲性生物標(biāo)志物去共同探測(cè)腫瘤內(nèi)源性及對(duì)ICI的免疫變化，也可作為ICI反應(yīng)性的預(yù)測(cè)標(biāo)記，并監(jiān)測(cè)腫瘤的持久性和免疫激活。
參考文獻(xiàn)：
Shi Alvin., Kasumova Gyulnara G., Michaud William A., Cintolo-Gonzalez Jessica., Díaz-Martínez Marta., Ohmura Jacqueline., Mehta Arnav., Chien Isabel., Frederick Dennie T., Cohen Sonia., Plana Deborah., Johnson Douglas., Flaherty Keith T., Sullivan Ryan J., Kellis Manolis., Boland Genevieve M.(2020). Plasma-derived extracellular vesicle analysis and deconvolution enable prediction and tracking of melanoma checkpoint blockade outcome. Sci Adv, 6(46), undefined. doi:10.1126/sciadv.abb3461