circRNAs是一類非編碼RNAs,可通過(guò)與miRNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá);此外,circRNAs已經(jīng)被證明參與了幾個(gè)病理過(guò)程。然而circCUL2在胃癌(GC)中的表達(dá)及生物學(xué)功能尚不清楚。那么小編為大家?guī)?lái)近期發(fā)表于影響因子15.302的“Molecular Cancer”上的文章“circCUL2 regulates gastric cancer malignant transformation and cisplatin resistance by modulating autophagy activation via miR-142-3p/ROCK2”,為大家詳細(xì)介紹circCUL2在胃癌中的作用和具體分子機(jī)制。
我們發(fā)現(xiàn)circCUL2在GC組織和細(xì)胞系中下調(diào)。circCUL2抑制GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外,circCUL2在耐順鉑GC細(xì)胞系中下調(diào),并調(diào)節(jié)了順鉑的敏感性。circCUL2可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-142-3p、調(diào)節(jié)ROCK2表達(dá)和自噬激活,參與腫瘤發(fā)生和化療耐藥性。
技術(shù)路線:
結(jié)果:
1) circCUL2在GC組織和細(xì)胞中的表達(dá)和特征
我們應(yīng)用芯片技術(shù)來(lái)探索幾種circRNAs在胃癌組織和鄰近組織之間的差異表達(dá)?;诓町惐磉_(dá)的基因以及GO和KEGG分析結(jié)果,我們選擇circCUL2進(jìn)行進(jìn)一步研究。與成對(duì)的非癌組織相比,胃癌組織中circCUL2的表達(dá)明顯降低(圖1a)。通過(guò)ROC分析circCUL2對(duì)GC的診斷價(jià)值,ROC曲線下面積為0.790 (圖1b)。Kaplan-Meier分析顯示circCUL2水平低的胃癌患者總生存率較差(圖1c)。然后,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè),與正常血清相比,GC血清中circCUL2水平明顯降低(圖1d)。此外,AGS和SGC-7901細(xì)胞株中的circCUL2水平降低,選擇進(jìn)行進(jìn)一步研究(圖1e)。
隨后,我們通過(guò)Sanger測(cè)序?qū)ircCUL2 qRT-PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行了驗(yàn)證,靶區(qū)為頭尾剪接位點(diǎn),序列與circBase數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列一致(圖1f)。circCUL2可以抵抗RNase R的處理(圖1g-i),聚合引物擴(kuò)增的線性CUL2被RNase R消化(圖1g-i)。此外,在經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理的AGS和SGC-7901細(xì)胞系中,CUL2的線性轉(zhuǎn)錄本的半衰期比circCUL2短(圖1j)。核質(zhì)RNA qRTPCR和FISH抗circCUL2的結(jié)果顯示,circCUL2優(yōu)先定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖k-l)。這些結(jié)果表明circCUL2可能參與了GC的發(fā)生發(fā)展,circCUL2穩(wěn)定且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。
2) circCUL2抑制GC細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化
為了進(jìn)一步探究circCUL2對(duì)GC細(xì)胞的功能作用,我么利用RNA干擾和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)(圖2a)。CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)證實(shí)circCUL2下調(diào)增強(qiáng)了GC細(xì)胞的增殖能力(圖2b-c)。circCUL2抑制也增強(qiáng)了對(duì)菌落形成的影響(圖2d)。此外,通過(guò)Transwell和傷口愈合檢測(cè)細(xì)胞遷移,發(fā)現(xiàn)circCUL2特異性siRNA增加了細(xì)胞遷移(圖2e和f)。在circCUL2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中,細(xì)胞浸潤(rùn)被抑制,而在circCUL2表達(dá)降低的細(xì)胞中,細(xì)胞浸潤(rùn)被促進(jìn)(圖2f)。過(guò)表達(dá)circCUL2則產(chǎn)生相反的效果,它抑制了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲(圖2b-f)。
3) circCUL2作為miR-142-3p海綿
circCUL2的細(xì)胞質(zhì)定位提示circCUL2可能在轉(zhuǎn)錄后水平參與了GC的發(fā)展。為了研究選擇性剪接機(jī)制,我們檢測(cè)了CUL2在GC組織中的線性表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示CUL2在GC組織中升高,但與circCUL2無(wú)相關(guān)性(圖3a-b)。此外,抑制或過(guò)表達(dá)circCUL2均不會(huì)改變線性CUL2的mRNA表達(dá)水平(圖3c)。在排除了選擇性剪接機(jī)制后,我們下一步研究了circCUL2結(jié)合miRNAs的能力。CircInteractome和circRNABase工具用于預(yù)測(cè)可能與circCUL2序列結(jié)合的潛在靶標(biāo)miRNAs(圖3d)。結(jié)合GC組織的miRNA芯片(圖3e),選擇miR-142-3p和miR-653。在circCUL2 siRNA或circCUL2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒處理的細(xì)胞中,只有miR-142-3p水平升高或降低(圖3f)。然后,利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能分析,篩選出miRanda、miRBridge、PicTar、PITA和TargetScan預(yù)測(cè)的miR-142-3p的靶基因(圖3g)。只有ROCK2被發(fā)現(xiàn)受到circCUL2和miR-142-3p的調(diào)控(圖3h)。基于這些結(jié)果,我們推測(cè)circCUL2可能作為miR142-3p海綿調(diào)節(jié)ROCK2。
4) 體內(nèi)circCUL2、miR-142-3p和ROCK2的表達(dá)
為了研究circCUL2、miR-142-3p和ROCK2在體內(nèi)的作用,我們對(duì)circCUL2和miR-142-3p在GC組織中的作用進(jìn)行了FISH檢測(cè)。結(jié)果顯示,circCUL2和miR-142-3p共局域化,表達(dá)相反(圖4a)。在GC組織中,miR142-3p的miRNA水平顯著上調(diào)(圖4b),而ROCK2的mRNA和蛋白水平顯著降低(圖4c-d)。此外,miR-142-3p與circCUL2或ROCK2表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān),而circCUL2和ROCK2表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(圖4e-g)。接著,將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circCUL2OE或空載體的細(xì)胞皮下接種于裸鼠,密切監(jiān)測(cè)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)4周。我們的結(jié)果表明,來(lái)自circCUL2-OE細(xì)胞的腫瘤明顯小于來(lái)自空載體-的腫瘤轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖4h)的體積和重量(圖4i-j)。基于FISH(圖4k)觀察了circCUL2和miR-142-3p的共定位。
5) circCUL2在體外通過(guò)miR-142-3p/ROCK2調(diào)控惡性轉(zhuǎn)化
在體外我們進(jìn)一步研究了circCUL2/miR-142-3p/ROCK2是否能夠調(diào)控腫瘤的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)circCUL2和ROCK2可以與miR-142-3p結(jié)合(圖5a)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),miR-142-3p可以直接結(jié)合circCUL2和ROCK2的3'UTR位點(diǎn)(圖5b)。RNA下拉結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,circCUL2特異性探針下拉樣品中circCUL2和miR-142-3p顯著富集(圖5c)。接下來(lái),我們?cè)贏GS和SGC-7901細(xì)胞系中使用抗AGO2抗體進(jìn)行RIP。結(jié)果顯示circCUL2和miR-142-3p被抗AGO2抗體沉淀后顯著富集(圖5d)。此外,我們還探討了circCUL2/miR-142-3p調(diào)控GC進(jìn)展的潛在機(jī)制。miR-142-3p模擬物或circCUL2 siRNA誘導(dǎo)的ROCK2 mRNA和蛋白水平下降,分別通過(guò)過(guò)表達(dá)circCUL2或轉(zhuǎn)染miR-142-3p抑制劑逆轉(zhuǎn)(圖5e和f)。此外,在AGS和SGC-7901細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-142-3p可提高增殖率(圖5gh)、遷移能力和侵襲能力(圖5j-k)。為了進(jìn)一步確定circCUL2是否通過(guò)與miR-142-3p相互作用發(fā)揮其功能,我們將miR-142-3p模擬物和circCUL2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到GC細(xì)胞中。過(guò)表達(dá)circCUL2的細(xì)胞中,miR-142-3p對(duì)GC細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)促進(jìn)的影響被逆轉(zhuǎn)(圖5g-k)。這些數(shù)據(jù)表明circCUL2通過(guò)吸附miR-142-3p抑制GC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
6) circCUL2調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性
由于circCUL2下游的miR-142-3p和ROCK2可能與胃癌預(yù)后相關(guān),我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)miR-142-3p的高表達(dá)和ROCK2的低表達(dá)可導(dǎo)致無(wú)病生存(DFS)或DFS聯(lián)合化療縮短(圖6a-b)。提示circCUL2可能參與了GC細(xì)胞的化療耐藥性。因此,我們篩選順鉑、5-FU、DOX和MMC,以確定circCUL2對(duì)其敏感性影響最大的藥物。結(jié)果顯示,升高的circCUL2主要抑制順鉑處理的細(xì)胞活力,而降低的circCUL2主要誘導(dǎo)順鉑耐藥(圖6c)。干擾circCUL2可以提高IC50,而過(guò)表達(dá)circCUL2可以降低IC50(圖6d)。
為了驗(yàn)證circCUL2調(diào)控順鉑敏感性的假設(shè),我們構(gòu)建了順鉑耐藥AGS/DDP和SGC-7901/DDP細(xì)胞系。與正常GC細(xì)胞系相比,順鉑耐藥GC細(xì)胞系circCUL2和ROCK2表達(dá)顯著降低,miR142-3p表達(dá)顯著升高(圖6e)。隨后,共轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物和circCUL2表達(dá)構(gòu)建物后,順鉑處理AGS/DDP和SGC-7901/DDP細(xì)胞系。當(dāng)細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-142-3p時(shí),circCUL2誘導(dǎo)的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)(圖6f-i)。此外,異種移植瘤數(shù)據(jù)顯示,高水平的circCUL2顯著降低了異種移植瘤的生長(zhǎng),并使細(xì)胞對(duì)順鉑治療敏感(圖6j-k)。qRT-PCR結(jié)果顯示,circCUL2的上調(diào)可顯著誘導(dǎo)circCUL2和ROCK2的mRNA水平,而異種移植標(biāo)本中miR-142-3p的水平則受到抑制(圖6l)。這些數(shù)據(jù)表明,過(guò)表達(dá)的circCUL2通過(guò)吸附miR-142-3p促進(jìn)順鉑的敏感性。
7) circCUL2通過(guò)靶向順鉑耐藥GC細(xì)胞中的miR-142-3p抑制自噬
自噬與miR-142-3p和ROCK2的差異表達(dá)相關(guān)。circCUL2提高了順鉑在GC中的敏感性,因此我們有興趣研究circCUL2是否通過(guò)miR-142-3p在AGS/ DDP和SGC-7901/DDP細(xì)胞系中抑制自噬。與預(yù)期一樣,WB分析顯示,過(guò)表達(dá)circCUL2增加了ROCK2和p62的表達(dá),而miR-142-3p模擬物則挽救了它們(圖7a)。此外,circCUL2抑制了自噬活性的標(biāo)記物L(fēng)C3和Beclin1的表達(dá),但在順鉑耐藥的GC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-142-3p時(shí),這種作用被逆轉(zhuǎn)(圖7a)。與模擬細(xì)胞相比,外源GFPLC3B質(zhì)粒預(yù)處理后的DDP處理細(xì)胞中,GFP-LC3B斑點(diǎn)顯著增加,表明自噬小泡形成(圖7b)。此外,過(guò)表達(dá)circCUL2的細(xì)胞自噬小泡的形成比載體處理的細(xì)胞少。自噬小泡形成的減少可以被miR-142-3p模擬物逆轉(zhuǎn)(圖7b)。同樣,免疫熒光法計(jì)算的LC3蛋白表達(dá)量(圖7c)和透射電鏡觀察的自噬小體數(shù)(圖7d)與GFP-LC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果的趨勢(shì)相同。因此,這些結(jié)果表明circCUL2通過(guò)miR-142-3p/ROCK2在順鉑耐藥GC細(xì)胞中抑制自噬。
結(jié)論:circCUL2可能通過(guò)miR-142-3p/ROCK2介導(dǎo)的自噬激活作為腫瘤抑制因子和順鉑敏感性調(diào)控因子,可能是胃癌的關(guān)鍵機(jī)制和治療靶點(diǎn)。