研究思路探索：非編碼RNA與巨噬細(xì)胞活化

導(dǎo)語(yǔ)：哮喘是兒童和成人最常見的慢性呼吸道疾病之一，其重要分子機(jī)制是炎癥。巨噬細(xì)胞是肺內(nèi)最豐富的免疫細(xì)胞，在以2型反應(yīng)為主的過敏性哮喘中起重要作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(lncRNAs)的失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，在免疫系統(tǒng)的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。非編碼RNA與巨噬細(xì)胞活化的研究思路值得探索。

參考文獻(xiàn)：Xia L , Wang X , Liu L , et al. Lnc-BAZ2B promotes M2 macrophage activation and inflammation in asthmatic children through stabilizing BAZ2B pre-mRNA[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020. （IF: 10.228）

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1. lnc-BAZ2B在哮喘兒童中上調(diào)

為鑒定哮喘兒童中差異表達(dá)的lncRNA，通過轉(zhuǎn)錄組芯片分析哮喘兒童和健康對(duì)照PBMCs中lncRNA和mRNA表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)719個(gè)lncRNA基因在哮喘患兒中存在差異表達(dá)，34個(gè)上調(diào)的非外顯子正義lncRNA具有基因符號(hào)描述，選擇5個(gè)使用RT-qPCR在另外50例哮喘患者和46例健康對(duì)照的PBMC樣本數(shù)量中驗(yàn)證。分析哮喘患者PBMCs中mRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)382個(gè)mRNA在哮喘患者中存在差異表達(dá)，基因本體富集分析發(fā)現(xiàn)2型免疫反應(yīng)和2型免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)類別富集，表明2型免疫反應(yīng)在過敏性哮喘中起重要作用。

評(píng)估PBMCs中T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞中LncRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LOC643072主要在單核細(xì)胞中表達(dá)。LOC643072的表達(dá)在IL-4誘導(dǎo)的m2巨噬細(xì)胞活化過程中增強(qiáng)，在LPS誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞活化過程中下降。表明LOC643072可能在巨噬細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。lncRNA LOC643072的序列定位在其順式基因的反鏈上，與鋅指結(jié)構(gòu)域2B(BAZ2B)相鄰的溴結(jié)構(gòu)域，因此被命名為lnc-BAZ2B。

2. Lnc-BAZ2B促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化

為確定Lnc-BAZ2B是否調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化，評(píng)估了IL-4刺激后Lnc-BAZ2B功能喪失和獲得對(duì)THP1來源的人巨噬細(xì)胞活化的影響。發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中lnc-BAZ2B敲除顯著損害了M2特異性標(biāo)記基因的表達(dá)，包括CLEC7A、IL1RA、CCL18和IRF4。相反，巨噬細(xì)胞過表達(dá)lnc-BAZ2B時(shí)，M2特異性標(biāo)記基因的表達(dá)水平顯著增加。提示lnc-BAZ2B促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化。STAT6是IL-4信號(hào)通路中的主要轉(zhuǎn)錄因子， IL-4刺激STAT6敲除的M2巨噬細(xì)胞中lnc-BAZ2B的表達(dá)水平急劇下降。綜上所述，提示IL-4通過STAT6活化誘導(dǎo)lnc-BAZ2B表達(dá)，然后促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化。

3. Lnc-BAZ2B通過增強(qiáng)BAZ2B表達(dá)促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化

研究lnc-BAZ2B對(duì)M2巨噬細(xì)胞活化的影響是否是由于其對(duì)BAZ2B表達(dá)的影響。lnc-BAZ2B敲除導(dǎo)致THP1來源的巨噬細(xì)胞中BAZ2B表達(dá)減少，而lnc-BAZ2B的過表達(dá)顯著增加BAZ2B mRNA的水平。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了lnc-BAZ2B可以正調(diào)控BAZ2B表達(dá)。IL-4刺激BAZ2B敲除的M2巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出M2相關(guān)基因的表達(dá)顯著降低。當(dāng)BAZ2B被敲除時(shí)，lnc-BAZ2B的表達(dá)沒有差異，表明lnc-BAZ2B是BAZ2B的上游調(diào)節(jié)因子。

當(dāng)lnc-BAZ2B或BAZ2B/ Baz2b下調(diào)時(shí)，編碼控制M2巨噬細(xì)胞活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF4的表達(dá)水平顯著降低，IRF4和M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因的水平隨著lnc-BAZ2B的過表達(dá)而上調(diào)。在過表達(dá)lnc-BAZ2B的巨噬細(xì)胞中敲低IRF4的表達(dá)，觀察到M2巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)被逆轉(zhuǎn)。這表明lnc-BAZ2B和BAZ2B主要通過上調(diào)IRF4促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化。由于BAZ2B是H3K14ac閱讀器，使用抗H3K14ac抗體進(jìn)行了ChIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)H3K14ac確實(shí)在IRF4啟動(dòng)子處富集。提示BAZ2B作為H3K14ac閱讀器，主要通過上調(diào)IRF4的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化。

4. Lnc-BAZ2B通過穩(wěn)定pre-mRNA增強(qiáng)BAZ2B的表達(dá)

lnc-BAZ2B以35%:65%的比例在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
lncBAZ2B序列定位于其順式基因BAZ2B的反鏈，lnc-BAZ2B的59末端與BAZ2B pre-mRNA的59末端互補(bǔ)。lnc-BAZ2B敲低后，BAZ2B前RNA和成熟mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，過表達(dá)lnc-BAZ2B的巨噬細(xì)胞中，BAZ2B和BAZ2B pre-mRNA的表達(dá)均上調(diào)。RNase保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用位于lnc-BAZ2B和BAZ2B互補(bǔ)區(qū)域的引物時(shí)，RNase A1T消化后仍可通過PCR擴(kuò)增BAZ2B pre-mRNA。這些結(jié)果表明，lnc-BAZ2B和BAZ2B的pre-mRNA可能形成雙鏈體，保護(hù)BAZ2B premRNA不被RNA酶降解。放線菌素D（轉(zhuǎn)錄抑制劑）處理巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著lnc-BAZ2B的過表達(dá)，放線菌素D處理后巨噬細(xì)胞中BAZ2的降解慢。說明lnc-BAZ2B在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控BAZ2B表達(dá)。提示lnc-BAZ2B和BAZ2B的pre-mRNA可以形成雙鏈體，增加BAZ2B pre-mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)一步增加BAZ2B成熟mRNA的水平。

5. Lnc-BAZ2B和BAZ2B加劇CRE-誘導(dǎo)的肺部炎癥

在CRE-誘導(dǎo)肺部炎癥小鼠中出現(xiàn)哮喘病理學(xué)，炎癥細(xì)胞顯著募集至肺部，致密的支氣管周圍浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞增生，CRE-處理小鼠中lnc-BAZ2B過表達(dá)顯著增強(qiáng)肺部炎癥，CRE處理的Baz2b敲低小鼠顯示肺部炎癥減少，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞減少，Muc5ac表達(dá)水平降低。

肺部炎癥，比較不同組小鼠肺組織中小鼠M2巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志基因的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)CRE-處理小鼠中M2特異性標(biāo)記基因的表達(dá)水平，包括Mrc1、Arg1、Clec7a和Irf4，增加，Baz2b mRNA表達(dá)高于PBS激發(fā)小鼠。這些結(jié)果表明lnc-BAZ2B和BAZ2B可以通過促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化加劇變應(yīng)原誘導(dǎo)的肺部炎癥。

6. 哮喘患兒PBMCs中Lnc-BAZ2B表達(dá)與BAZ2B表達(dá)相關(guān)

進(jìn)一步驗(yàn)證lnc-BAZ2B和BAZ2B是否通過促進(jìn)體內(nèi)M2巨噬細(xì)胞活化加劇CRE-誘導(dǎo)的哮喘。測(cè)定過敏性哮喘兒童和健康對(duì)照受試者PBMCs中Lnc-BAZ2B和BAZ2B的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)哮喘兒童中lnc-BAZ2B的表達(dá)水平顯著高于健康兒童。在哮喘兒童中檢測(cè)到lnc-BAZ2B和BAZ2B之間呈正相關(guān)。lnc-BAZ2B表達(dá)較高的哮喘患者的血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分比高于lnc-BAZ2B表達(dá)水平較低的患者。這些發(fā)現(xiàn)暗示lnc-BAZ2B有可能作為兒童哮喘的生物標(biāo)志物。

總結(jié)：1.首次證明lnc-BAZ2B通過促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化增強(qiáng)過敏性哮喘的疾病嚴(yán)重程度。

     2. Lnc-BAZ2B通過雙鏈體形成增強(qiáng)BAZ2B pre-mRNA的穩(wěn)定性，BAZ2B增加M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄。

     3. lnc-BAZ2B和BAZ2B在過敏性哮喘進(jìn)展中至關(guān)重要，可作為兒童哮喘的潛在治療和診斷靶點(diǎn)。