開發(fā)出治療帕金森病新策略！包覆基因-化學(xué)納米復(fù)合物的外泌體可以清除α突觸核蛋白和激活帕金森病免疫
2020年12月，來自中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室、中國科學(xué)院大學(xué)與北京理工大學(xué)生物工程學(xué)院團隊合作在Science advance雜志上發(fā)表了文章“Targeted exosome coating gene-chem nanocomplex as "nanoscavenger" for clearing α-synuclein and immune activation of Parkinson's disease.”。此文獻描述了一個工程核-殼雜交系統(tǒng)，名為狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽修飾的外泌體(EXO) curcumin/苯基硼酸-聚(2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯)納米粒子/靶向SNCA (REXO-C/ANP/S)的小干擾RNA。它是一種清除-突觸核蛋白聚集物并降低其在帕金森病神經(jīng)元中的細胞毒性的納米清除劑。經(jīng)REXO-C/ANP/ s治療后，帕金森病小鼠的運動行為得到顯著改善。團隊也證明REXO-C/ANP/S是一種清除免疫激活的納米清除劑，因為其天然不成熟的樹突狀細胞外膜?？傊?，REXO-C/ANP/S可作為神經(jīng)退行性疾病的治療平臺。
對于神經(jīng)退行性疾病，可以利用基因和小分子藥物協(xié)同清除引起神經(jīng)元變性的病理物質(zhì)。
在帕金森病(Parkinson s disease, PD)中，α突觸核蛋白 (α-syn)聚集物被認為是主要的病理物質(zhì)。siRNA在罕見疾病或沒有良好藥物選擇的疾病中表現(xiàn)出潛力，但與基因相關(guān)。例如，針對SNCA的siRNA (siSNCA)可以通過下調(diào)α-syn蛋白的合成來抑制α-syn聚集物的形成。神經(jīng)保護小分子藥物姜黃素對已有的α-syn聚集物具有降低作用。因此，siSNCA與姜黃素聯(lián)合可以協(xié)同降低α-syn聚集物對PD治療多巴胺能神經(jīng)元的細胞毒性。然而，因為它們的吸收能力差，新陳代謝快，這些生物利用度較差的藥物難以在靶神經(jīng)元的作用部位聚集。此外,腦輸送問題主要表現(xiàn)為輸送系統(tǒng)難以通過血腦屏障(BBB)，不能準確識別靶細胞。
合成基因和化學(xué)藥物(gene-chem)納米復(fù)合物，包括脂質(zhì)體和聚合物顆粒，已被修飾為細胞穿透多肽或細胞靶向分子，以增強藥物輸送在腦疾病或其他疾病的治療。然而，合成的納米復(fù)合物容易被識別為外來物，導(dǎo)致自然免疫激活、細胞凋亡、血液循環(huán)時間短，不安全且效率低。此外，當這些合成載體被內(nèi)化時，會經(jīng)歷一個內(nèi)溶酶體途徑，這往往導(dǎo)致藥物降解和胞外作用，并導(dǎo)致炎性小體激活。此外，有必要控制藥物在病變區(qū)域的釋放，以減少非特異性毒性。因此，為了有效地將基因化學(xué)藥物遞送到靶細胞的作用部位以實現(xiàn)PD的安全治療，有必要開發(fā)一種能夠克服這些遞送瓶頸的遞送系統(tǒng)，包括低血腦屏障通透性、神經(jīng)元靶向性差、胞漿內(nèi)吞效率低下和藥物釋放不可控等。
為了實現(xiàn)上述目標，作者設(shè)計了一種靶向外泌體涂層基因-化學(xué)納米復(fù)合物，作為神經(jīng)元α-syn聚集物和PD免疫激活的工程納米清除劑。外泌體是一種經(jīng)過充分研究的siRNA和化學(xué)藥物的天然源載體，直徑為30至100納米。它具有一種膜結(jié)構(gòu)，其表面特異性蛋白四asppanin CD9促進直接膜融合，并幫助內(nèi)部物質(zhì)直接運輸?shù)绞荏w細胞的細胞質(zhì)中，避免了溶酶體誘捕。
進一步有效地提供藥物通過BBB和多巴胺能神經(jīng)元,第一個過程的工程是構(gòu)建殼,REXO一種靶向的未成熟樹突狀細胞(imDC)衍生的外泌體，該外泌體由狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽修飾而成，具有29個氨基酸，能特異性結(jié)合神經(jīng)元細胞和BBB表達的乙酰膽堿受體。由于外泌體很難同時裝載親水基因和疏水小分子藥物，工程的第二個過程是作為一個基因-化學(xué)包覆核心的產(chǎn)品實現(xiàn)的，這是一個響應(yīng)活性氧(ROS)的基因化學(xué)藥物納米復(fù)合物裝載這兩種不同特性的藥物。第三種工藝是REXO-C/ANP/S納米清除劑的制備。REXO被涂在納米復(fù)合物上形成納米清除劑。因此，該工程傳遞系統(tǒng)能夠有效穿過血腦屏障，靶向神經(jīng)元，并在多巴胺能神經(jīng)元病變的高ROS環(huán)境中釋放藥物。富集的siSNCA和姜黃素對α-syn蛋白下調(diào)和α-syn聚集抑制具有協(xié)同作用。
技術(shù)路線：
一、REXO-C/ANP/S的制備方法及表征
雜化納米粒子(NP) REXO-C/ANP/S的制備由兩部分組成(圖1A):基因化學(xué)核心C/ANP/S的制備和REXO的獲取。核心C/ANP/S是通過兩步法得到的。首先，我們合成了聚合物ba -聚(2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯)(BAP)和bb -聚(2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯)(BBP)(圖S1A)。
核磁共振H表明BAP和BBP合成成功(圖S1, B到D)。兩親性聚合物BAP可自組裝并包封疏水性藥物姜黃素，形成姜黃素/BAP NP (C/ANP)。采用Multiskan光譜法計算姜黃素在NP中的加載率，加載率為70%。接下來，通過靜電相互作用形成最終的C/ANP/siSNCA (C/ANP/S)和C/BNP/siSNCA (C/BNP/S)納米配合物(圖1A)。隨后運用gel retardation assay，現(xiàn)siSNCA完全附著在5的N/P(聚合物的氮部分/ siRNA的磷部分)C/ANP(圖S2A)。
第二部分是rvg修飾外泌體的制備REXO，使用頻率為40 kHz、功率為100 W的bath超聲器，通過超聲波方法組裝內(nèi)芯和外部REXO(圖1A)。。
分離并收集含有外泌體的指定編號7,8,9的片段。通過透射電子顯微鏡(TEM)確定imDC外泌體為囊泡結(jié)構(gòu)，水動力直徑約為70 nm, zeta電位為12.7 mV(圖2E)。
DiD外泌體與硬脂酰rvgfitc的共定位系數(shù)為0.95(圖S3E)，表明RVG成功修飾外泌體。
組裝過程假設(shè)如圖1B所示，并通過TEM、尺寸和zeta電位測量進行驗證(圖1C)。
在REXO和C/ANP/S復(fù)合物中，在REXO-to-C/ANP/S質(zhì)量比0.05以下，REXO吸附到C/ANP/S部分表面(圖1C, I)。
當NPs的質(zhì)量比為0.01時，NPs的粒徑增加到141.0 nm, zeta電位下降到7.05 mV。當比值為0.05時，存在一個中間態(tài)。尺寸增大到437.5 nm, TEM顯示C/ANP/S通過REXO交聯(lián)(圖1C, II)。最后，負電荷占主導(dǎo)地位的NPs趨于穩(wěn)定。
當質(zhì)量比為0.1時，最終的核-殼單分散組裝形成如圖1C (III)所示，這表明REXO被涂覆在核納米配合物的表面。最終的NP REXO-C/ANP/S帶負電荷7.1 mV，流體動力直徑為118.1 nm(圖1D)。
接下來，為了便于直觀觀察組裝組分，制備了帶正電的聚殼聚糖微球，允許帶負電的組裝體在表面吸附(圖1E)。
外泌體用親脂性染料DiI標記。結(jié)果清楚地顯示了DiI外泌體、Cy5-siRNA和姜黃素的共定位(圖1E和圖S3F)。
此外，組裝后得到的REXO-C/ANP/S含有EXO的TSG101和CD9蛋白(圖1F)，進一步表明包衣成功。
二、通過REXO涂層增強REXO- c /ANP/S的藥物傳遞
模擬REXO-C/ANP/S和C/ANP/S的體外給藥過程。我們使用Transwell培養(yǎng)法模擬血腦屏障(圖2A, I)。
bEnd.3細胞在Transwell插入物中培養(yǎng)7天(6孔中插入1x105個細胞，孔徑0.4 m, 4.67 cm2)，形成單層細胞，經(jīng)上皮電阻至少200歐姆·cm2。
加入NPs后，利用柯達體內(nèi)成像系統(tǒng)FX Pro進行生物發(fā)光成像，檢測Cy5平均熒光強度。REXO涂層顯著增強了C/ANP/S中siRNA藥物進入bEnd.3細胞。然后通過上皮細胞分化為SH-SY5Y細胞(圖2A, II至IV)。作為比較,增加免費RVG肽抑制促進效應(yīng)(圖2,II IV)。通過比較的siRNA SH-SY5Y細胞在不同時間點(圖2 b),發(fā)現(xiàn)REXO涂層顯著提高藥物的吸收在C / ANP / S。2小時后，EXO和REXO包衣組EXO-C/ANP/S和REXO-C/ANP/S顯著優(yōu)于裸姜黃素和siRNA(裸C + S)以及內(nèi)核C/ANP/S。這是因為C/ANP/S中的季胺類化合物通過核內(nèi)體-溶酶體途徑將C/ANP/S內(nèi)吞，造成NP外排和藥物損失，因此藥物積累隨著時間的增加并不明顯(圖2B)。
共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)實驗結(jié)果比較了兩種體系的內(nèi)吞機制(圖2C)。
隨著時間的延長，DiI的熒光增強，從5分鐘到1小時，明顯與深紅色膜染色的熒光共定位(圖2D和圖S4B)。
α-syn聚集物是PD神經(jīng)元的主要病理物質(zhì)。因此，清除PD處理中的α-syn聚集物和多余的-syn非常重要(圖3A)。
裸藥和不同NPs與SNCA mCherry SH-SY5Y細胞共培養(yǎng)2天。 CLSM觀察到-α-syn mCherry過表達細胞系中的α-syn聚集物，其中mCherry為α-syn的紅色報告因子(圖3B)。
Western blot也驗證了總α-syn表達[圖。3、C和D;47 kDa (α-syn為18 kDa, mCherry為29 kDa)]。
與無姜黃素的NP REXO-ANP/S和siNonsense NP REXO-C/ANP/siNonsense相比，REXO-C/ANP/S具有下調(diào)優(yōu)勢。
此外，除REXO-C/ANP/ siNonsense處理的細胞外，np處理的細胞SNCA mRNA表達低于pbs處理的細胞。REXO-C/ANP/S處理后的細胞SNCA mRNA表達下降64%(圖3E)。此外，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)顯示，NP用藥組處理的細胞中-syn聚集物顯著減少(圖3F)。
四、增強體內(nèi)神經(jīng)元恢復(fù)
給藥10次后記錄行為。PD小鼠在開闊區(qū)域表現(xiàn)出運動遲緩，并且在中間區(qū)域行走較少(圖4A, II)。
在開闊場地進行30分鐘的定量數(shù)據(jù)顯示，它們的總距離減小，移動速度減慢，所需的休息時間變長[圖2]。4、B to D (II)。
NP組小鼠的運動能力有改善的趨勢，尤其是REXO-C/ANP/S組[圖4]。4、B到D (III到VI)]。
在極點實驗中，經(jīng)過REXO-C/ANP/S處理后，到達桿尖的時間明顯縮短(圖4E)。
這種優(yōu)勢在小鼠解剖后的大腦切片中也得到了體現(xiàn)。注射REXO-C/ANP/S的PD小鼠神經(jīng)元修復(fù)效果優(yōu)于其他各組(圖4,F和G)。
此外，蘇木精對np處理過的小鼠臟器載玻片染色表明其安全性，不會對小鼠肝臟或其他臟器造成負擔(圖S7)。
通過對處理小鼠SN區(qū)進行染色，我們得出協(xié)同載藥C/ANP/S納米復(fù)合物對TH+神經(jīng)元α-syn有清除作用，但EXO-C/ANP/S和REXO-C/ANP/S的清除作用更明顯，特別是靶向NP REXO-C/ANP/S(圖5,a和C)。這是由于靶向外泌體優(yōu)越的遞送優(yōu)勢。此外，我們還探索了小鼠免疫微環(huán)境的改善。結(jié)果表明，imDC外泌體的作用可以清除PD小鼠的T細胞激活。在小鼠經(jīng)NPs處理后，我們發(fā)現(xiàn)EXO-C/ANP/S，特別是REXO-C/ANP/S可以顯著增加CD4陽性(CD4+) T細胞中Fox p3的表達(圖5,B和D)。
此外，REXO-C/ANP/S可顯著增加PD中TGF-和IL-10(圖5,E, F)。已有研究證實TGF-信號具有抗炎作用，主要是神經(jīng)保護作用。此外，IL-22和IL-17與自身免疫性疾病相關(guān)，并以免疫細胞因子的形式高表達。激活的TH17細胞分泌并產(chǎn)生IL-22和IL-17免疫細胞因子。結(jié)果表明，REXO-C/ANP/S可顯著降低PD中IL-22和IL-17因子(圖5,G和H)。