YTHDF1通過以m6A依賴的方式促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展

肝細(xì)胞癌(HCC)是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，是全球第四大癌癥相關(guān)死亡原因。新的證據(jù)表明，m6A在腫瘤進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。然而，YTHDF1在HCC的生物學(xué)功能仍不清楚。發(fā)表于影響因子7.032的“Mol Ther Nucleic Acids”的“YTHDF1 Facilitates the Progression of Hepatocellular Carcinoma by Promoting FZD5 mRNA Translation in an m6A-Dependent Manner”詳細(xì)介紹了YTHDF1在HCC中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制。在這里，我們發(fā)現(xiàn)在HCC組織和細(xì)胞系中YTHDF1的表達(dá)顯著升高，并且與HCC患者的預(yù)后顯著相關(guān)。此外，在HCC中，YTHDF1的表達(dá)受USF1和c-MYC轉(zhuǎn)錄調(diào)控。功能研究表明，YTHDF1在體內(nèi)外均可促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。多組學(xué)分析顯示，YTHDF1可以以m6A依賴的方式加速FZD5 mRNA的翻譯輸出，并通過WNT/β-catenin途徑作為癌基因發(fā)揮作用。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

（1）   YTHDF1表達(dá)在HCC中顯著上調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)

為了探索YTHDF1在HCC的調(diào)節(jié)作用，我們首先分析了它的表達(dá)。TCGA數(shù)據(jù)庫、GSE14520數(shù)據(jù)集和GSE94660數(shù)據(jù)集顯示YTHDF1在HCC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)(圖1A)。此外，我們通過臨床樣本的qRT-PCR和免疫組織化學(xué)(IHC)分析檢測了YTHDF1的表達(dá)，與相鄰正常組織相比，HCC組織中YTHDF1在mRNA和蛋白水平上均過表達(dá)(圖1B和1C)。此外，qRT-PCR分析證實，與LO2細(xì)胞相比，HCC細(xì)胞中的YTHDF1表達(dá)升高(圖1D)。為探討YTHDF1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，我們根據(jù)YTHDF1表達(dá)的中值將HCC患者分為兩組。用Kaplan-Meier法進(jìn)行的生存分析表明，高YTHDF1表達(dá)的HCC患者經(jīng)歷了更糟糕的OS(圖1E)。有趣的是，與相應(yīng)的正常組織相比，在多種實體惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)YTHDF1的表達(dá)顯著上調(diào)(圖1F)。根據(jù)上述數(shù)據(jù)，我們得出結(jié)論，YTHDF1的表達(dá)在HCC顯著上調(diào)，并與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。

（2）   YTHDF1的表達(dá)由USF1和c-MYC共同控制

鑒于轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)中的廣泛調(diào)節(jié)作用，我們旨在研究在YTHDF1的表達(dá)是否受到特定轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。UCSC基因組瀏覽器數(shù)據(jù)庫顯示YTHDF1啟動子在多種細(xì)胞系中非?；钴S，包括HepG2細(xì)胞(圖2A)。我們接下來分析了從ENCODE數(shù)據(jù)庫下載的HepG2細(xì)胞ChIP-seq數(shù)據(jù)。如圖2A所示，在YTHDF1啟動子中c-MYC/MAX和USF1的潛在結(jié)合(圖2A)。c-MYC/MAX和USF1位于E-box的290bp (圖2B)。此外，熒光素酶活性顯示，在HEK293T細(xì)胞中用c-MYC或USF1過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染YTHDF1啟動子報告子后，只有野生型推定結(jié)合位點增加了YTHDF1啟動子的激活(圖2C)。qRT-PCR和免疫印跡分析表明，c-MYC/USF1的缺失減少了但過表達(dá)增加了YTHDF1在基因和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，當(dāng)c-MYC和USF1都受到調(diào)節(jié)時，這種表達(dá)更為有效(圖2D和2E)。IHC分析顯示，與ANTs相比，c-MYC和USF1在HCC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，并與YTHDF1的表達(dá)呈正相關(guān)(圖2F和2G)。綜上所述，在HCC，YTHDF1的表達(dá)由USF1和c-MYC共同控制。

（3）   YTHDF1促進(jìn)HCC細(xì)胞體外增殖和轉(zhuǎn)移

為了研究YTHDF1在HCC的生物學(xué)功能，我們設(shè)計了慢病毒介導(dǎo)的shYTHDF1和CRISPR-dCas9基因激活系統(tǒng)，分別在HCC細(xì)胞中敲除和過表達(dá)YTHDF1的表達(dá)(圖3A和3B)。集落形成試驗顯示，YTHDF1敲除明顯抑制，但YTHDF1過表達(dá)顯著增強(qiáng)HCC細(xì)胞的集落形成能力(圖3C)。CCK-8分析和EdU分析顯示沉默YTHDF1可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，而上調(diào)YTHDF1可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖(圖3D和3E)。Transwell顯示，YTHDF1下調(diào)和上調(diào)分別顯著抑制和提高了HCC細(xì)胞的遷移和侵入能力(圖3F和3G)。上述結(jié)果表明YTHDF1在HCC細(xì)胞中發(fā)揮致癌作用。

（4）   YTHDF1促進(jìn)體內(nèi)HCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

為了研究YTHDF1在HCC體內(nèi)的致癌作用，我們用YTHDF1沉默的MHCC-LM3細(xì)胞和YTHDF1過表達(dá)的HepG2細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行了皮下植入實驗。數(shù)據(jù)顯示，YTHDF1敲除有效減少，但YTHDF1過表達(dá)顯著增加腫瘤大小和重量(圖4A-4D)。并通過HE染色驗證各組腫瘤組織(圖4E)。接下來，進(jìn)行qPCR分析以確認(rèn)異種移植腫瘤組織中YTHDF1的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，YTHDF1沉默的MHCC-LM3細(xì)胞形成的腫瘤組織顯示出降低的YTHDF1表達(dá)，而來自YTHDF1過表達(dá)的HepG2細(xì)胞的腫瘤組織顯示出增加的YTHDF1表達(dá)(圖4F)。為了評價YTHDF1是否能促進(jìn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移，我們通過靜脈注射YTHDF1沉默的MHCC-LM3細(xì)胞和YTHDF1過表達(dá)的HepG2細(xì)胞建立了體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型。我們觀察到，與對照組相比，YTHDF1敲除組肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較少，而YTHDF1過表達(dá)組肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較多(圖4G和4H)?？偟膩碚f，我們的發(fā)現(xiàn)揭示了YTHDF1促進(jìn)體內(nèi)HCC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

（5）   將FZD5確定為YTHDF1在HCC的直接目標(biāo)

為了鑒定YTHDF1的靶標(biāo)，我們首先分析了具有YTHDF1敲除的細(xì)胞的公共核糖體圖譜數(shù)據(jù)(GSE 63591)。YTHDF1的缺失導(dǎo)致1982個轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率降低(圖5A)。為了選擇與YTHDF1直接結(jié)合的靶點，我們下載了GSE63591中YTHDF1的RNA RIP-seq和PARCLIP-seq數(shù)據(jù)，并與核糖體-seq數(shù)據(jù)重疊。我們發(fā)現(xiàn)YTHDF1的缺失導(dǎo)致與YTHDF1結(jié)合的413個基因的翻譯效率降低(圖5B)。KEGG分析表明，這些轉(zhuǎn)錄物在11種信號通路中顯著富集，如Hippo和WNT信號通路(圖5C)，其中FZD5、FZD7、FZD9和WNT3在大多數(shù)通路中富集(8/11)。有趣的是，當(dāng)我們使用GSE112705數(shù)據(jù)集在HCC中檢測FZD5、FZD7、FZD9和WNT3的表達(dá)豐度和翻譯效率時，我們發(fā)現(xiàn)FZD5的表達(dá)豐度比FZD7、FZD9和WNT3高得多，并且與ANTs相比，FZD5在大多數(shù)HCC組織中的轉(zhuǎn)錄效率得到提高(圖5D和5E)?？紤]到m6A的修飾具有高度的細(xì)胞類型特異性，我們分析了GSE9064212中的HepG2細(xì)胞RNA-seq和m6A-seq數(shù)據(jù)，以驗證FZD5基因的m6A修飾，結(jié)果表明METTL14的敲除顯著降低了人肝癌細(xì)胞中m6A的水平，而不是FZD5基因的表達(dá)水平(圖5F)。IHC分析顯示，與ANTs相比，FZD5在HCC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)(圖5G)，并且與YTHDF1的表達(dá)呈強(qiáng)正相關(guān)(圖5H)。

（6）   YTHDF1以m6A依賴的方式促進(jìn)FZD5 mRNA的翻譯

為了驗證FZD5基因和YTHDF1蛋白之間的直接結(jié)合，我們進(jìn)行了RIP實驗。半定量PCR和qRT-PCR分析顯示與免疫球蛋白G相比，FZD5 mRNA與YTHDF1蛋白結(jié)合顯著富集(圖6A和6B)。此外，敲除YTHDF1導(dǎo)致FZD5在蛋白質(zhì)水平上的顯著抑制(圖6C)，但在mRNA水平上沒有(圖6D)。為了排除YTHDF1可能影響FZD5蛋白穩(wěn)定性，我們用環(huán)己酰亞胺(CHX)處理HepG2和MHCC-LM3細(xì)胞以阻斷翻譯，并發(fā)現(xiàn)FZD5蛋白表達(dá)在載體組和shYTHDF1組中類似地被消除(圖6E)。上述結(jié)果表明，由YTHDF1沉默引起的FZD5蛋白表達(dá)的消除是由于mRNA翻譯效率的降低，而不是轉(zhuǎn)錄或蛋白穩(wěn)定性的降低。

眾所周知，YTHDF1通過結(jié)合m6A甲基化轉(zhuǎn)錄物發(fā)揮作用。因此，我們首先使用MeT-DB V2.0數(shù)據(jù)庫篩選了HepG2細(xì)胞中FZD5基因的m6A位點，該數(shù)據(jù)庫顯示FZD5基因m6A位點富集在位于chr 2:208632313–208632314的蛋白質(zhì)編碼序列(CDS)中(圖6F)。MeRIP-PCR證實了m6A修飾在該位點的顯著富集(圖6G)。此外，熒光素酶分析顯示，YTHDF1過表達(dá)增強(qiáng)了FZD5-WT的表達(dá)(圖6H)。此外，METTL3敲除(圖6I和6J)顯著降低了HCC細(xì)胞中m6A總水平(圖6K)和FZD5蛋白表達(dá)(圖6J)，FZD5 mRNA表達(dá)略有上調(diào)(圖6L)。此外，RIP分析顯示，METTL3敲除顯著抑制了YTHDF1和FZD5 mRNA之間的結(jié)合(圖6M)。我們的結(jié)果表明，YTHDF1選擇性地識別FZD5基因CDS中的m6A位點，并隨后促進(jìn)其翻譯輸出。

（7）   FZD5過表達(dá)有效逆轉(zhuǎn)YTHDF1敲除誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞進(jìn)程抑制

為了探索FZD5在HCC的調(diào)節(jié)作用，我們通過轉(zhuǎn)染具有生物活性的重組人FZD5來過表達(dá)FZD5 (圖7A)。細(xì)胞表型顯示FZD5上調(diào)顯著促進(jìn)了HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲(圖7B-7F)。接下來，我們在YTHDF1缺陷型HCC細(xì)胞中過表達(dá)FZD5，以研究YTHDF1的致癌作用是否由FZD5直接介導(dǎo)。集落形成試驗、CCK-8試驗和EdU試驗表明，YTHDF1敲除損害了細(xì)胞集落形成和生長，而FZD5上調(diào)逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)(圖7B-7D)。一致地，Transwell分析顯示，在HCC細(xì)胞中FZD5過表達(dá)后，由YTHDF1耗竭抑制的細(xì)胞遷移和侵入能力重新建立(圖7E和7F)。

（8）   YTHDF1通過WNT/β-Catenin信號通路促進(jìn)HCC癌的發(fā)生

據(jù)報道，FZD5過表達(dá)在肝癌中激活WNT/β-Catenin途徑。接下來，我們研究了YTHDF1是否通過FZD5/WNT/β-Catenin發(fā)揮作用。亞細(xì)胞分級和免疫印跡分析顯示，YTHDF1的敲除顯著降低了HCC細(xì)胞中β-Catenin的總表達(dá)和核表達(dá)，而FZD5的上調(diào)逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)(圖8A)。此外，我們發(fā)現(xiàn)YTHDF1敲除不影響細(xì)胞外鈣的濃度(圖8B)和磷酸化JNK水平(圖8C)。這些結(jié)果證實了YTHDF1在HCC的致癌作用是通過WNT/β-Catenin途徑而不是WNT/Ca2+途徑或平面細(xì)胞極性途徑介導(dǎo)的。眾所周知，c-Myc基因是一種由WNT/β-Catenin信號轉(zhuǎn)錄激活的癌基因，它在很大程度上參與了各種癌癥的發(fā)展。免疫組化分析表明，YTHDF消耗抑制但FZD5的過表達(dá)重建了HCC細(xì)胞中c-MYC的表達(dá)(圖8A)。此外，IHC分析顯示，與陰性對照組相比，FZD5、β-Catenin和c-MYC在YTHDF1下調(diào)的異種移植腫瘤樣品中的表達(dá)顯著降低(圖8D)。此外，我們在HCC的TCGA數(shù)據(jù)庫中觀察到FZD5、β-Catenin、cMYC和YTHDF1表達(dá)呈正相關(guān)(圖8E)。綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)表明YTHDF1通過FZD5/WNT/β-Catenin信號通路促進(jìn)HCC細(xì)胞的致癌作用(圖8F)。

結(jié)論：YTHDF1可以通過FZD5/WNT/β-Catenin信號通路，以m6A依賴的方式提高FZD5 mRNA的翻譯輸出，促進(jìn)HCC細(xì)胞的進(jìn)程。我們的研究為HCC提供了一個潛在的治療策略。