非酒精性脂肪肝炎的兇手-肝細(xì)胞焦亡

導(dǎo)語：非酒精性脂肪肝炎(NASH)是非酒精性脂肪肝的晚期疾病，肝細(xì)胞的脂毒性損傷可能是NASH發(fā)生的主要事件，可導(dǎo)致炎癥，但NASH脂毒性的性質(zhì)和機制尚不完全清楚。焦亡是新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細(xì)胞死亡方式，參與各種病理進程。肝細(xì)胞焦亡是否是引發(fā)NASH的兇手之一呢？一起來看吧。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1. SMS1在HFHCD喂養(yǎng)的小鼠肝臟中表達(dá)增加
用高脂、高膽固醇飼料(HFHCD)喂食小鼠12周可誘導(dǎo)NASH，而喂食高脂飼料(HFD)的小鼠發(fā)生單純性脂肪變性，無顯著炎癥和纖維化，HFHCD喂食小鼠中肝細(xì)胞凋亡明顯，HFHCD顯著增加鞘脂生物合成的關(guān)鍵因素-Spt2的表達(dá)，增加神經(jīng)酰胺、SM和DAG的水平，并降低磷脂酰膽堿(PC)的水平，增加SMS1的肝臟表達(dá)，但未增加Sms2。這些表明，HFHCD喂養(yǎng)上調(diào)SMS1的表達(dá)。

2. FC誘導(dǎo)SMS1表達(dá)

檢測蛋氨酸和膽堿缺乏飲食(MCDD)和西方飲食（富含脂肪、膽固醇和果糖）誘導(dǎo)的其他NASH模型中肝臟SMSs的表達(dá)。MCDD和Western飲食喂養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞凋亡增加，SMS1表達(dá)增加，表明SMS1誘導(dǎo)是NASH的特征性表現(xiàn)，與肥胖無關(guān)。接受肝移植的NASH/肝硬化患者樣本顯示SMS1的高表達(dá)，SMS1的表達(dá)在脂肪變性受試者的肝臟標(biāo)本中沒變化。這些發(fā)現(xiàn)表明，較高的肝臟SMS1表達(dá)可能是NASH的共同特征。

膽固醇和SM共同富集在相同的膜結(jié)構(gòu)域中，其濃度受到嚴(yán)格調(diào)控，以維持膜特性和信號通路。因此，檢測游離膽固醇(FC)水平的增加是否誘導(dǎo)SMS1的表達(dá)。
喂食HFHCD、MCDD或西方飲食的小鼠肝臟中FC水平升高，小鼠喂食富含膽固醇的飼料，發(fā)現(xiàn)增加肝臟Sms1表達(dá)，但未增加Sms2。此外，用水溶性膽固醇和?；o酶a膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Avasimibe（維持膽固醇未酯化形式）處理肝細(xì)胞，可顯著增加Sms1表達(dá)，膽固醇和Avasimibe顯著增加Sms1啟動子活性，表明FC在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)Sms1上調(diào)。綜上所述，這些結(jié)果表明FC的積累刺激了NASH中Sms1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

3. SMS1敲除阻止NASH的發(fā)展

為進一步闡明SMS1在NASH中的作用，檢測了SMS1敲除在HFHCD喂養(yǎng)的小鼠中的作用。Sms1敲低改善了HFHCD誘導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化，降低了單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Mcp-1)、腫瘤壞死因子-α(Tnf-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Tgf-β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-Sma)和III型膠原蛋白α1(Col3a1)的表達(dá)，降低血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平，但未顯著改變肝臟甘油三酯水平（。因此得出結(jié)論，SMS1介導(dǎo)飲食誘導(dǎo)的肝損傷、炎癥和纖維化，但不介導(dǎo)脂肪變性。

4. SMS1介導(dǎo)飲食誘導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡

接下來檢測SMS1是否介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡。喂食HFHCD的小鼠中分離的肝細(xì)胞（HFHCD肝細(xì)胞）顯示出SMS1蛋白水平升高和上清液中LDH釋放增加。此外，HFHCD肝細(xì)胞中GSDMD-N水平升高，GSDMD-N是NASH中焦亡細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素，而壞死性凋亡標(biāo)志物的磷酸化水平未發(fā)生變化。這些共同表明焦亡特異性地發(fā)生在HFHCD肝細(xì)胞中。這 些表明SMS1和HFHCD誘導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡之間聯(lián)系緊密。來自焦亡肝細(xì)胞的條件培養(yǎng)基激活了LPS致敏的Kupffer細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體，增加IL-1β水平，肝臟Sms1敲低后抑制這種效應(yīng)。

5. NASH動物肝細(xì)胞中NLRC4依賴性焦亡

在HFHCD喂食小鼠的分離肝細(xì)胞和肝臟提取物中，NLRC4的水平均顯著較高，HFHCD肝細(xì)胞中NLRP3和NLRC4的表達(dá)增加。Sms1敲除并不影響NLRP3的表達(dá)，但消除了HFHCD介導(dǎo)的NLRC4磷酸化。敲除Nlrc4并不顯著影響肝臟脂肪變性，但可預(yù)防NASH，并顯著降低gasdermin-D活化和肝細(xì)胞死亡。Nlrc4敲除后HFHCD喂食小鼠的肝細(xì)胞上清液誘導(dǎo)LPS預(yù)處理的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β顯著降低。由于DAG是由SMS產(chǎn)生的，可激活PKCδ，探索了SMS1和PKCδ激活之間的聯(lián)系。PKCδ磷酸化在HFHCD喂養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞中較高，但在Sms1敲除的HFHCD喂養(yǎng)的小鼠中不高。此外，通過HFHCD喂食Pkcδ敲低小鼠可預(yù)防NASH，并顯著降低NLRC4的磷酸化。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)SMS1和NLRC4通過PKCδ活化誘導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡的聯(lián)系。

6. Caspase-1基因敲除對小鼠肝細(xì)胞焦亡有保護作用，而Nlrp3基因敲除小鼠沒有

研究NLRP3-caspase1軸在HFHCD誘導(dǎo)的NASH和肝細(xì)胞焦亡中的作用。Caspase-1和Nlrp3 K/O小鼠均可免受HFHCD誘導(dǎo)的肝臟炎癥和纖維化，從喂食HFHCD的Caspase-1 K/O小鼠獲得的肝細(xì)胞可預(yù)防焦亡。喂食HFHCD的Caspase-1 K/O小鼠的肝細(xì)胞條件培養(yǎng)基未能誘導(dǎo)LPS致敏的對照小鼠Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，喂食HFHCD的Nlrp3 K/O小鼠肝細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)LPS致敏的對照小鼠Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生顯著的IL-1β。提示caspase-1，而非NLRP3，是HFHCD喂養(yǎng)誘導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡的必要條件。

結(jié)論：1.肝細(xì)胞中的FC誘導(dǎo)Sms1表達(dá)，可阻止HFHCD誘導(dǎo)的NASH。
            2. SMS1產(chǎn)生的DAG通過依次激活PKCδ-NLRC4軸誘導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡和NASH。

參考文獻(xiàn)：Koh, E., et al., Sphingomyelin synthase 1 mediates hepatocyte pyroptosis to trigger non-alcoholic steatohepatitis. Gut, 2020. （IF=19.819）